NS5ATP3通过调节胆固醇代谢促进HepG2细胞生长

作者：刘雨薇; 韩凯; 韩铭; 袁晓雪; 梁璞; 成军^*

来源：中国肝脏病杂志(电子版), 2022, 14(02): 1-10.

• 肝细胞癌
• 胆固醇代谢
• NS5ATP3
• FoxM1
• HMGCR

目的 探讨NS5ATP3在非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）相关肝细胞癌（hepatic cell carcinoma,HCC）发生发展中的作用机制。方法 转染p NS5ATP3或si-NS5ATP3后检测Hep G2细胞内总胆固醇（totalcholesterol,TC）水平，分别采用CCK8法、划痕实验、Caspase-3活性检测法检测细胞增殖、凋亡及迁移情况。通过聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RTPCR）和Westernblot检测胆固醇合成、细胞增殖、凋亡及细胞周期相关基因和蛋白（SREBP2、HMGCR、Fox M1）的表达。比较共转染p NS5ATP3和si-HMGCR与单纯转染p NS5ATP3时下游HCC关键基因Fox M1的表达水平及细胞增殖能力。结果 NS5ATP3过表达增加了细胞内TC水平[（0.044±0.008）pmol/mg vs(0.034±0.004)pmol/mg;t=3.231,P=0.023）]，而NS5ATP3沉默后降低了TC水平[（0.025±0.002）pmol/mg vs(0.033±0.003)pmol/mg;t=3.846,P=0.009）]。Western blot表明，与对照组相比，过表达NS5ATP3可引起SREBP2和HMGCR蛋白水平增加，p-AMPKα水平显著降低；沉默NS5ATP3后，SREBP2和HMGCR蛋白水平下降，p-AMPKα水平增高。q RTPCR结果也显示，与对照组相比，NS5ATP3过表达上调SREBP2m RNA(2.45±0.75vs1±0.33;t=5.159,P=0.037)和HMGCR m RNA(2.30±0.30 vs 1±0.10;t=4.432,P=0.047)的表达，而沉默NS5ATP3后，SREBP2 m RNA(0.24±0.21 vs 1±0.26;t=4.769,P=0.041)和HMGCRm RNA(0.47±0.13vs1±0.21;t=4.522,P=0.046)表达水平显著下降。在48 h和72 h时，过表达NS5ATP3组细胞相对活力显著高于对照组（1.85±0.06 vs 1.56±0.12,t=4.583,P=0.010;3.08±0.19 vs 2.61±0.21,t=4.790,P=0.009）,24 h时差异无统计学意义（1.10±0.06 vs 1±0.08,t=1.873,P=0.088）。在24 h、48 h和72 h时，沉默NS5ATP3组细胞相对活力均显著低于对照组（0.90±0.07vs 0.98±0.09,t=3.378,P=0.020;1.57±0.05 vs 1.63±0.11,t=2.717,P=0.035;1.82±0.23 vs 2.61±0.21,t=5.010,P=0.004）。与对照组相比，过表达NS5ATP3后，细胞中caspase-3/7水平降低（0.69±0.09 vs 1±0.15;t=3.128,P=0.026），而沉默si NS5ATP3后，caspase-3/7活性增高（1.34±0.11vs1±0.05;t=5.141,P=0.004）。在24 h、48 h和72 h，过表达NS5ATP3后，细胞迁移率显著升高（21.00±2.08 vs 33.33±2.40,t=3.879,P=0.018;67.33±1.20vs78.00±1.53,t=5.488,P=0.005;85.33±2.60vs99.00±0.58,t=5.125,P=0.007）；沉默NS5ATP3后，细胞迁移能力显著下降（36.00±2.65 vs 24.33±2.91,t=2.969,P=0.041;67.33±1.20 vs 48.00±3.22,t=5.633,P=0.005;92.33±1.45 vs 83.33±1.67,t=4.070,P=0.015）。过表达NS5ATP可显著上调Fox M1m RNA(1.43±0.10vs1±0.06;t=3.533,P=0.024)和CCNB1 m RNA表达（2.07±0.16 vs 1±0.28;t=4.305,P=0.013）；沉默NS5ATP3可显著下调Fox M1 m RNA(0.47±0.17 vs 1±0.21;t=3.153,P=0.034)和CCNB1 m RNA(0.49±0.20 vs 1±0.11;t=3.676,P=0.021)的表达水平。Western blot表明，过表达NS5ATP3后，Fox M1和Bcl-2的蛋白质表达水平上调；沉默NS5ATP3后，Fox M1和Bcl-2的蛋白表达水平下调。HMGCR基因沉默后Fox M1 m RNA(0.63±0.18 vs 1±0.17;t=2.698,P=0.036)和蛋白质表达水平均显著下降，提示Fox M1受HMGCR调控。与单纯过表达NS5ATP3相比，同时过表达NS5ATP3和沉默HMGCR,HMGCR m RNA(0.83±0.17 vs 2.13±0.26;t=7.776,P=0.016)和Fox M1 m RNA(0.92±0.21 vs 1.48±0.10;t=4.323,P=0.049)表达水平均显著下降，48 h细胞增殖相对活力也显著降低（0.91±0.18 vs 1.33±0.04;t=4.946,P=0.016）。结论 NS5ATP3通过HMGCR-Fox M1轴参与HCC的发生发展，部分解释了NAFLD相关HCC的分子机制。

• 单位
  首都医科大学附属北京世纪坛医院; 首都医科大学附属北京地坛医院