非洲猪瘟病毒的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法的建立

作者：徐博文; 周傲白雪; 林志达; 梁基壮; 罗宝正^*

来源：黑龙江畜牧兽医, 2023, (14): 86-139.

DOI：10.13881/j.cnki.hljxmsy.2022.08.0039

• 非洲猪瘟病毒(ASFV)
• 重组酶聚合酶扩增(RPA)
• CRISPR-Cas12a系统
• 快速检测
• 方法建立

为了建立一种特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(ASFV)快速检测方法，试验针对ASFV B646基因保守片段设计并合成特异性crRNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3),并根据crRNA所在的基因序列区域设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物(RPA1-F/RPA1-R、RPA2F/RPA2-R),通过筛选最佳RPA引物-crRNA序列组合和crRNA浓度建立ASFV的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法，在评估该方法的特异性和灵敏度后对ASFV阳性临床样本进行验证。结果表明：最佳RPA引物-crRNA序列组合为RPA2-crRNA3,最佳crRNA浓度为5μmol/L;该方法仅能检测出ASFV,不能检测出猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2),特异性良好；最低检测病毒浓度为5.8 copies/μL,灵敏度较高；应用该方法对20份ASFV阳性临床样本进行检测，结果均为阳性，符合率为100%。说明成功建立了ASFV的RPA-CRISPR-Cas12a快速检测方法，该方法特异性好、灵敏度高，可用于ASFV的现场快速检测。

• 单位
  珠海市斗门区基壮农业发展有限公司; 拱北海关技术中心