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摘要
研究旨在证明熊果酸通过抑制hedgehog信号通路激活结直肠癌HCT116细胞的自噬。采用MTT法测定熊果酸对HCT116细胞活力的影响;结晶紫染色和划痕试验分别检测熊果酸对HCT116细胞增殖和迁移的影响。针对自噬的研究,首先进行时间点的筛选,利用Cell MeterTMAutophagy Assay Kit检测熊果酸作用于HCT116不同时间点的自噬荧光强度;Western blot法检测熊果酸作用于HCT116不同时间点的自噬蛋白P62的表达水平。然后利用Cell MeterTMAutophagy Assay Kit检测不同剂量熊果酸对HCT116细胞自噬荧光强度的影响;Western blot法检测不同剂量熊果酸对HCT116细胞LC3Ⅱ和P62蛋白表达水平的影响。进一步采用AdPlus-mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染检测熊果酸对HCT116细胞自噬流的影响;熊果酸与自噬抑制剂氯喹(CQ)联合利用Western blot法检测自噬蛋白LC3Ⅱ的表达水平。在机制方面,通过Western blot法检测熊果酸对HCT116细胞中hedgehog信号通路相关蛋白的影响。实验结果表明,熊果酸抑制HCT116细胞的活性、增殖和迁移;增强HCT116细胞自噬体的荧光强度,同时升高自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达水平和抑制P62的表达水平,并且呈时间和剂量依赖性;熊果酸激活HCT116细胞自噬流,表现为熊果酸导致自噬荧光斑点聚集并增强自噬体的荧光强度,而且与单独使用熊果酸相比,联合使用自噬抑制剂CQ能提高LC3Ⅱ的表达水平;熊果酸降低hedgehog信号通路中PTCH1,GLI1,SMO,SHH,c-Myc的表达水平,提高Sufu的表达水平。总之,该研究表明熊果酸激活结直肠癌HCT116细胞自噬,其机制可能是通过抑制hedgehog信号通路活性。
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