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摘要
背景视网膜新生血管常伴随微小RNA(miRNA)表达水平的变化。实时定量PCR是miRNA表达谱分析的常用方法,但内参基因在不同实验条件下可能呈现出差异性表达,如果以表达水平有显著波动的管家基因作为内参基因,可能会影响目的基因表达的结果评估,确定稳定表达的内参基因是进行后续研究的前提。目的比较氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠眼球组织中常用的miRNA内参基因及其他几种内参基因表达水平的差异及稳定性,筛选在OIR模型和正常发育条件下均稳定表达的最佳miRNA内参基因。方法应用随机数字表法抽取正常清洁级C57BL/6J P7、P12、P17、P37不同日龄小鼠及成年鼠(8周龄)各10只,小鼠在相应时间点颈椎脱臼法处死,收集眼球组织,应用实时定量PCR技术检测用于评估核小分子RNA U6(RNU6)、5S核糖体RNA(5s rRNA)、核仁小分子RNA U68(U68)、核仁小分子RNA U70(U70)、核仁小分子RNA U49A(U49A)5种内参基因在正常发育的不同日龄(P7、P12、P17、P37及成年)小鼠中表达的动态变化;另选取P7幼鼠40只,采用随机数字表法随机分为OIR组和正常对照组,每组20只。正常对照组小鼠在正常氧环境下饲养,OIR组小鼠在体积分数(75±2)%的高氧环境中饲养10d。分别选取P17 OIR组和正常对照组小鼠各5只,进行球后静脉荧光素视网膜血管造影,并制备视网膜铺片,另各取5只小鼠处死后制备视网膜切片行组织病理学检查,以验证是否造模成功。然后应用实时定量PCR技术检测上述5种内参基因在正常对照组和OIR组小鼠视网膜组织中的表达差异;应用GeNorm程序对内参基因表达的稳定性进行分析。结果在不同日龄正常小鼠视网膜中,内参基因U68的表达水平变化最大,其次为U49A、U70、RNU6、5s rRNA;内参基因U68、U49A、U70、RNU6在不同日龄小鼠视网膜中的相对表达量的总体差异均有统计学意义(U70:F=7.005、P=0.000;U68:F=10.189,P=0.000;U49A:F=21.134,P=0.000;RNU6:F=4.968,P=0.004),而5s rRNA在不同日龄小鼠视网膜中的相对表达量差异无统计学意义(F=2.099,P=0.107),P17 OIR组小鼠视网膜铺片显示,视网膜血管迂曲,可见视网膜无灌注区,苏木精-伊红染色可见突破视网膜内界膜的新生血管芽,而正常对照组小鼠视网膜均正常。在P17 OIR组小鼠内参基因U70表达水平变化最大,其次为U49A,U68、5s rRNA;U70、U49A、U68、5s rRNA在OIR组和正常对照组小鼠视网膜中表达量的差异均有统计学意义(t=5.174,p=0.000;t=3.376,P=0.012;t=4.802,P=0.000;t=2.856,P=0.029),RNU6的相对表达量在2个组间的差异无统计学意义(t=2.104,P=0.065)。GeNorm程序分析结果显示,不同日龄的正常小鼠眼球中所选内参基因表达稳定度为5s rRNA/RNU6>U70>U49A>U68,最佳内参基因组合为5s rRNA和RNU6;在P17OIR组小鼠眼球组织中所选内参基因的表达稳定度为5s rRNA/RNU6>U68>U49A>U70,最佳内参基因组合亦为5s rRNA和RNU6。结论应用实时定量PCR技术研究miRNA基因表达时,应根据不同的研究对象和处理条件选择合适的内参基因。在OIR模型中,综合考虑发育、缺氧等因素的影响,在条件允许的情况下可优先选择5s rRNA和RNU6组合作为小鼠眼球组织miRNA表达分析的内参基因。
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单位宜宾市第一人民医院; 天津医科大学; 天津医科大学眼科医院
