基因真核表达质粒的构建及鉴定

作者：蔡蕊; 万里; 吕盼盼; 王莉娟; 罗秋月; 宋婷婷; 丁倩; 李亚玲; 姚德祎; 熊绍权^*

来源：中华医学遗传学杂志, 2018, 35(03): 385-388.

• AY358935基因
• 真核表达质粒构建
• M14细胞

目的构建AY358935基因的真核表达质粒并进行初步鉴定。方法以逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)扩增AY358935基因的cDNA,将该片段克隆进pGEM-Teasy载体;以测序正确的pGEM-T-AY重组质粒为模板构建pcDNA3.1-AY真核表达质粒,并进行双酶切鉴定。以pcDNA3.1-AY瞬时转染M14细胞,Western印迹法和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)- dimethylthiahiazo (-z-y1)-3, 5-di- phenytetrazoliumromide, MTT]比色法分别检测转染细胞AY358935蛋白表达水平及细胞增殖力。结果 RT-PCR扩增片段符合AY358935基因cDNA大小,与pcDNA3.1-AY克隆区酶切片段一致。对pGEM-T-AY质粒克隆区测序,结果也与AY358935基因cDNA序列相同。M14细胞分别转染AY358935基因、pcDNA3.1和脂质体48h后,AY358935基因组蛋白表达水平明显高于其余两组,且AY358935基因组细胞A值(0.74)也明显高于其余两组(0.39和0.46),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 AY358935基因的真核表达质粒pcDNA3.1-AY构建成功,AY358935基因可能具有促进M14细胞增殖的作用。

• 单位
  成都中医药大学附属医院; 四川大学华西第二医院