兔出血症病毒衣壳蛋白VP60抗原区的原核表达及其免疫保护效果

作者：杨柳; 林永润; 牟豪; 许国洋; 余远迪; 沈克飞; 付利芝^*

来源：中国生物制品学杂志, 2021, 34(06): 671-677.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003356

• 兔出血症病毒
• VP60蛋白
• 基因重组
• 原核表达
• 免疫保护

目的原核表达兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60抗原区,并检测其免疫保护效果。方法采用RT-PCR法从感染RHDV死兔肝脏中扩增RHDV VP60基因,克隆基因并进行测序和生物信息学分析。用柔性连接肽(Gly4Ser)3串联VP60蛋白两抗原区域,根据E. coli密码子偏好性优化合成编码串联蛋白的DNA序列,插入至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒,转化感受态E. coli BL21(DE3)。挑选阳性克隆菌培养,用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导表达,产物经Ni2+-NTA金属螯合蛋白层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot检测。将纯化蛋白经背部皮下免疫家兔,1.0 mg/只,共免疫3次,每次间隔2周。分别于免疫前、首次免疫后14、28、42 d经耳静脉采血,分离血清,ELISA法检测RHDV抗体水平;末次免疫2周,经家兔腿部肌肉注射RHDV SZ/2013强毒株病毒液,2 mL/只,每天观察家兔症状,攻毒后10 d剖解观察脏器病理变化。结果扩增的VP60基因序列与RHDV山东分离株VP60基因的核苷酸相似性最高,达95.86%,将该毒株命名为RHDV Chongqing/2016,明确了两抗原区段为VP60氨基酸序列的N-末端L区和C-末端H区。重组表达质粒经菌落PCR及测序鉴定,证明构建正确。纯化蛋白相对分子质量约50 000,与兔抗RHDV多克隆抗体可发生特异性结合。家兔免疫14 d即产生了抗RHDV特异性抗体,随时间延长呈逐渐升高趋势,且较稳定;攻毒后10 d内家兔无死亡,采食正常,无病症出现,保护率达100%;剖检可见家兔肝、肺和肾等脏器均正常,未见出血症状。结论原核表达了RHDV衣壳蛋白VP60抗原区,且具有良好的免疫保护作用,本实验为相应疫苗的研发提供了实验依据。

• 单位
  重庆市畜牧科学院; 西南大学荣昌校区