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摘要
目的探讨腺病毒介导的shRNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对活化肝星状细胞(HSC)的纽蛋白(vinculin)、细丝蛋白A(filamin A)及皮层肌动蛋白(cortactin)的影响。方法体外培养活化大鼠肝星状细胞系HSC-T6, 将携带靶向PTEN的RNA干扰序列[短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)]的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN及对照空病毒Ad-GFP转染HSC;采用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测各组HSC的PTEN mRNA及蛋白表达;借助激光扫描共聚焦显微镜, 采用免疫荧光法检测各组HSC的vinculin、filamin A及cortactin表达变化, 并利用Image-pro plus 6.0软件进行图像分析处理, 计算所测蛋白荧光表达的积分光密度值(IOD)。实验分为3组:对照组(在腺病毒转染步骤以DMEM代替腺病毒液)、Ad-GFP组(转染仅表达绿色荧光蛋白的空病毒Ad-GFP)、Ad-shRNA/PTEN组(转染携带靶向PTEN的shRNA并表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN)。3组间均数比较采用单因素方差分析, 组间比较采用LSD检验。结果靶向PTEN的shRNA成功转染并显著下调HSC的PTEN mRNA及蛋白表达(P < 0.05);HSC的vinculin主要表达于细胞质, Ad-shRNA/PTEN组HSC的vinculin荧光IOD (19 758.83±1520.60)较对照组(7 737.16±279.93)及Ad-GFP组(7 725.50±373.03)显著升高(P < 0.05), 而对照组与Ad-GFP组之间HSC的vinculin荧光IOD差异无统计学意义(P > 0.05)。3组HSC的filamin A荧光IOD差异无统计学意义(P > 0.05), 但3组HSC的filamin A亚细胞分布发生了变化, Ad-shRNA/PTEN组HSC的filamin A主要分布于细胞质, 而对照组和Ad-GFP组HSC的filamin A主要位于细胞核, Ad-shRNA/PTEN组HSC的filamin A核质比(0.60±0.15)明显低于对照组(1.20±0.15)及Ad-GFP组(1.08±0.23), P < 0.05;而对照组与Ad-GFP组之间HSC的filamin A核质比差异无统计学意义(P > 0.05)。3组HSC的cortactin主要分布于细胞质, Ad-shRNA/PTEN组HSC的cortactin荧光IOD(54 688.50±2 095.53)较对照组(22 959.94±1 710.42 )及Ad-GFP组(22 547.11±1 588.72)显著升高(P < 0.05), 而对照组与Ad-GFP组之间HSC的cortactin荧光IOD差异无统计学意义(P > 0.05)。结论 PTEN表达下调使体外活化肝星状细胞的微丝结合蛋白vinculin及cortactin的表达上调, 并使另一微丝结合蛋白filamin A的亚细胞分布发生改变即出现胞核向细胞质转位。
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单位华北理工大学; 沧州市人民医院
