伊氏锥虫伊犁株扩繁及其PFR基因克隆表达和生物信息学分析

作者：甘露; 郑会珍; 诺明达来; 刘燕; 金敏; 何文文; 温丽翠; 李永畅^*; 巴音查汗·盖力克^*

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(02): 469-478.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.02.005

• 伊氏锥虫
• 鞭毛束旁棒(PFR)
• 原核表达
• 遗传进化
• 生物信息学分析

【目的】本研究旨在研究锥虫入侵宿主细胞的机制并为其检测方法的建立奠定基础。【方法】采用已分离保存的伊氏锥虫在昆明白小鼠体内进行培养繁殖，对其鞭毛束旁棒(PFR)基因进行克隆，并构建系统发育树。通过生物信息学方法分析和预测PFR蛋白的理化特性、亲疏水性、跨膜区结构、二级结构和三级结构；构建原核表达载体pET28a-PFR,用Western blotting检测PFR重组蛋白的反应原性。【结果】在昆明白小鼠体内成功扩繁伊氏锥虫伊犁株，第5天染虫率达到最高；PFR基因PCR扩增片段大小为834 bp,与冈比亚布氏锥虫PFR基因(XP＿011775815.1)相似性为99.52%,基于PFR蛋白氨基酸序列的进化树显示，该虫株与冈比亚布氏锥虫的亲缘关系也最近。PFR蛋白分子式为C1416H2286N416O442S11,理论等电点为5.74,是一种碱性、亲水性及不稳定蛋白，没有跨膜区和信号肽，有10个潜在抗原表位；主要定位于细胞质中；PFR蛋白二级结构主要由α-螺旋组成(占92.34%),三级结构与二级结构一致。成功构建伊氏锥虫PFR基因表达质粒pET28a-PFR,经诱导时间、温度和IPTG浓度等条件优化后发现，浓度为1 mmol/L IPTG于37℃诱导重组菌液6 h时，PFR蛋白表达量最高，并且以包涵体的形式表达；Western blotting结果显示，重组蛋白与伊氏锥虫阳性血清反应为阳性。【结论】本试验成功在昆明白小鼠体内扩繁出伊氏锥虫，克隆了马伊氏锥虫PFR基因，构建了PFR原核表达载体，诱导表达出PFR重组蛋白，该蛋白具有良好的反应原性，为后续该蛋白功能和马伊氏锥虫的致病相关机制研究提供了理论依据。

• 单位
  新疆农业大学