生长素诱导的蛋白敲减系统在刚地弓形虫Chinese 1虫株中的应用及验证

作者：闫爱霞; 贾永根; 邹洋; 李晶晶; 黄敏君; 谷俊朝^*

来源：中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2020, 38(02): 207-212.

• 刚地弓形虫
• 吲哚乙酸
• 生长素诱导的蛋白敲减系统
• mCherry荧光蛋白

目的应用生长素诱导的蛋白敲减(AID)系统调控刚地弓形虫Chinese 1虫株中荧光蛋白的表达。方法人工合成3′端融合有标签FLAG的植物生长素受体——运输抑制剂响应蛋白1 (TIR1)的核苷酸序列TIR1-FLAG,将其连接至pTub-e GFP-CAT载体中,构建pTub-TIR1-FLAG-CAT表达质粒;表达质粒经电穿孔转染至弓形虫Chinese 1虫株TgCtwh3,经氯霉素筛选和极限稀释后筛选单克隆虫株。PCR扩增及蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测单克隆虫株中TIR1基因的插入和相应蛋白的表达,将验证正确的阳性克隆命名为TIR1虫株。构建表达荧光蛋白mCherry-Ty-AID报告基因的表达质粒pTub-mCherry-Ty-AID-DHFR,并通过电穿孔转染将其整合至TIR1虫株基因组中,乙胺嘧啶筛选后极限稀释筛选获得稳定表达mCherry-AID的虫株,命名为TIR1:m Cherry-AID虫株。将TIR1:mCherry-AID虫株的虫体分为吲哚乙酸(IAA)调控组和对照组,IAA调控组加IAA至终浓度500μmol/L,对照组加等量乙醇,培养3 h后,分别以抗TgGAP45和抗Ty-1抗体为一抗,间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting分析IAA调控下mCherry荧光蛋白的表达情况。结果 PCR扩增结果显示,在1 816 bp处有一条特异性扩增条带。Western blotting分析结果显示,抗FLAG-Tag抗体可识别TIR1虫株中相对分子质量(Mr)约70 000的蛋白;Ty-1抗体可在TIR1:mCherry-AID虫株的对照组中检测到约Mr58 000的特异性条带,与理论上C端融合了AID的mCherry-Ty蛋白大小相同;在IAA调控组中未检测到特异性条带。IFA结果显示,TIR1:mCherry-AID虫株对照组可见红色荧光蛋白,IAA调控组未检测到mCherry蛋白。结论应用AID系统可成功调控弓形虫Chinses 1虫株中mCherry荧光蛋白的表达。

• 单位
  北京热带医学研究所; 首都医科大学附属北京友谊医院