肺炎链球菌StkP激酶与β-内酰胺类抗生素结合能力及耐药相关性分析

作者：黄燕颖; 张新蔚; 楼永良; 严杰; 孙爱华

来源：中华微生物学和免疫学杂志, 2017, 37(06): 424-430.

DOI：10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2017.06.004

• 肺炎链球菌
• 丝氨酸/苏氨酸激酶
• β-内酰胺类抗生素
• 结合
• 基因敲除/耐药

目的确定肺炎链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶StkP与耐药相关性及其胞外区与β-内酰胺类抗生素结合的能力。方法采用插入失活法构建肺炎链球菌ATCC6306株stkP基因敲除(△stkP)突变株。采用E-test检测青霉素(PCN)和头孢噻肟(CTX)对△stkp突变株及其野生株的最低抑菌浓度(MIC)。采用生物信息学软件确定肺炎链球菌ATCC6306株丝氨酸/苏氨酸激酶编码基因(stkP)胞外区(EC-StkP)、构建EC-StkP三维空间结构模型、分析EC-StkP结构与功能关系。采用PCR扩增stkP基因胞外区片段(EC-stkP),T-A克隆后测序。构建EC-stkP原核表达系统,SDS-PAGE联合凝胶图像分析系统检查目的重组蛋白(EC-rStkP)表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯EC-rStkP。采用等温滴定量热法(VT-ITC)和表面等离子共振法(Biacore)检测EC-rStkP与PCN和CTX结合能力。结果肺炎链球菌ATCC6306株对PCN和CTX敏感(MIC=0.06和0.12μg/ml),但△stkP突变株对PCN和CTX高度耐药(MIC=16和32μg/ml)。肺炎链球菌ATCC6306株StkP C端295 aa片段为胞外区,该胞外区有4个青霉素结合蛋白和丝氨酸/苏氨酸激酶相关(PASTA)功能结构域。克隆的stkP胞外区序列与GenBank中相应基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.6%和100%。构建的ECstkP原核表达系统可表达可溶性EC-rStkP。PCN和CTX均能与EC-rStkP结合,但后者结合EC-rStkP能力强于前者。结论肺炎链球菌stkP基因与β-内酰胺类抗生素耐药性密切相关,其表达产物丝氨酸/苏氨酸激酶StkP具有识别并结合β-内酰胺类抗生素的能力。

• 单位
  浙江大学; 温州医科大学; 生命科学学院; 杭州医学院