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摘要
背景 氧化损伤是引起内皮细胞功能障碍和细胞死亡的重要因素之一,它还可导致视网膜血管性疾病的发生.复方血栓通对多种视网膜血管性疾病有一定的疗效,但分子机制尚不明确.目的 研究复方血栓通对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的人视网膜血管内皮细胞(RVECs)氧化损伤的保护作用及其机制.方法 分离健康人供体眼的视网膜,用组织块培养法进行人RVECs的原代培养,并用FITC-vWF染色流式细胞仪对培养细胞进行鉴定.取3～5代的细胞用于实验,在含有5×104个/L细胞密度的培养孔中分别加入质量浓度为0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.000 g/L复方血栓通溶液,各质量浓度复方血栓通组和t-BHP模型组均加入终浓度为100μmol/L t-BHP,干预24 h后用MTT法检测各组人RVECs的吸光度(A490)值以评估复方血栓通的细胞毒性.t-BHP模型组分别加入终浓度为75、100、200和300 μmol/L的t-BHP,相应的复方血栓通组在不同浓度t-BHP造成细胞氧化损伤的同时均加入终质量浓度为0.2500 g/L复方血栓通溶液,干预6h后,用MTT法检测复方血栓通对t-BHP引起氧化损伤的作用.用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和坏死率；用倒置显微镜和Hoechst33258细胞核染色观察各组细胞的形态学,利用免疫荧光法检测人RVECs中蛋白氧化损伤和DNA氧化损伤的生物标记物硝基酪氨酸(NT)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的表达；Western blot法检测t-BHP损伤6、12、24 h各组细胞核转录因子-KB(NF-KB)、p53、bcl-2和bax的蛋白表达水平.结果正常对照组、0.0625、0.1250、0.2500、0.5000、1.000 g/L复方血栓通组人RVECs的A490值总体比较差异无统计学意义(F=1.989,P＞0.05),75、100、200和300 μmol/L的t-BHP作用后细胞存活率下降,而相应的复方血栓通组细胞存活率均较t-BHP模型组升高,差异均有统计学意义(t=14.57、13.82、21.51、32.64,P＜0.05).分别用75、100、200、300 μmol/L t-BHP干预6h后细胞凋亡率和细胞坏死率升高,而细胞正常率均明显低于相应的复方血栓通组,差异均有统计学意义(t=14.908、5.495、17.165、26.330,P＜0.01).t-BHP模型组随着t-BHP浓度的增加,变形和死亡的人RVECs数目增加,但复方血栓通组细胞形态无明显变化,死亡细胞数减少.与相应的t-BHP模型组相比,不同质量浓度的复方血栓通组人RVECs中NT及8-OHdG的表达明显减少,NF-KB、p53和bax蛋白的表达水平明显降低,而bcl-2蛋白的表达升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 复方血栓通可保护人RVECs免受t-BHP诱导的氧化损伤,其机制可能是通过下调细胞中NF-KB、p53和bax蛋白的表达并上调bcl-2蛋白的表达.
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单位中山大学中山眼科中心; 眼科学国家重点实验室; 山东大学齐鲁医院
