一种基于ELISA检测氮芥诱导的MGMT-DNA交联体的方法

作者：阳慧琼; 程晋; 丁娇艳; 叶枫; 邹仲敏

来源：第三军医大学学报, 2016, 38(18): 1997-2001.

DOI：10.16016/j.1000-5404.201602026

• MGMT-DNA交联物
• ELISA
• SYBR GreenⅠ
• 氮芥

目的建立一种基于酶联免疫吸附法检测O6-烷基转移酶(O6-Methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)与DNA的交联体(MGMT-DNA crosslink,M-DPC)含量的简便方法。方法整合当前技术提取及纯化M-DPC、定量M-DPC样品中ds DNA含量、优化DPC中抗原在ELISA板的包被能力等关键环节。以不同浓度氮芥处理人支气管上皮细胞HBE,在指定的时间收集细胞,使用细胞核抽提/裂解/Tris饱和酚回收法制备M-DPC样品。采用SYBR GreenⅠ染色方法对M-DPC样品中ds DNA进行定量。采用全能核酸酶对M-DPC样品中脱氧核糖核酸降解,以增强M-DPC样品中抗原在ELISA板的包被能力。最终,包被后的多孔板检测采用常规的ELISA。结果无需高速离心机和放射性同位素等,使用常规方法提取了细胞M-DPC。SYBR GreenⅠ检测基因组ds DNA的线性范围为2 ng至1.5μg,可以用于提取的M-DPC所含ds DNA的定量,据此统一样本用量。M-DPC可以通过ELISA检出,且在一定范围内有线性关系。氮芥染毒3 h后M-DPC含量有显著增加,且对氮芥剂量有依赖。至24 h M-DPC含量无显著降低。结论所建立的ELISA检测M-DPC的方法快速、经济、灵敏、高通量,也可应用于部分其他交联蛋白的检测。氮芥染毒所致M-DPC形成有时间和剂量效应。

• 单位
  第三军医大学