季节性流感病毒H1N1实时荧光定量PCR检测方法的建立

作者：许黎黎; 鲍琳琳; 秦川

来源：中国比较医学杂志, 2011, (07): 62-66.

• 季节性流感病毒H1N1
• 荧光定量PCR
• 病毒载量

目的建立一种快速定量检测季节性流感病毒H1N1核酸的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。方法选择季节性流感病毒H1N1的保守基因NP基因作为检测靶目标,应用Clustal W软件进行序列同源性比对分析,筛选出季节性流感病毒H1N1特异性的保守序列作为引物候选区域,然后应用Primer Express及PrimerPremier 5.0软件包对候选引物进行进一步配对及筛选,得到最优特异性检测引物。同时,由病毒全长cDNA扩增出NP基因,琼脂糖凝胶电泳检测NP基因的扩增情况并对目的条带进行切胶回收及纯化,对回收后的NP全长基因进行核酸浓度测定,并换算成拷贝数,作为定量标准品。结果应用ABI公司的Power SYBR Green PCR MasterMix及StepOne实时荧光定量PCR仪,该检测系统灵敏度可达102 copies/μL,不同梯度标准品间线性关系(R2)达0.999,斜率为-0.3433,扩增效率为95.572%,所有标准品均在83.2℃出现尖且窄的特异性熔解峰。结论利用该检测系统可以快速定量检测季节性流感病毒H1N1,灵敏度高,可用作基础及临床实验室对季节性流感病毒H1N1感染的辅助诊断方法和临床效果的监测手段,对实验操作者要求相对较低,具有实际的应用价值。

• 单位
  中国医学科学院医学实验动物研究所; 国家中医药管理局