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摘要
目的 探讨左金丸(ZJW)对KRAS突变型大肠癌西妥昔单抗(CET)耐药的逆转作用及其机制。方法 (1)常规培养KRAS突变人结肠癌细胞HCT116，通过细胞增殖率(CCK-8法检测)确定ZJW无毒剂量(即10 mg·L-1)，观察ZJW、CET的协同效应(ZJW 10 mg·L-1与CET 100、200 mg·L-1具有协同效应，本研究选择CET 100 mg·L-1进行后续实验)。将处于对数生长期的HCT116细胞分为对照组、CET 100 mg·L-1组(CET组)、ZJW 10 mg·L-1组(ZJW组)、CET 100 mg·L-1+ZJW 10 mg·L-1组(ZJW+CET组)，作用48 h；采用流式细胞仪分析细胞周期和凋亡情况，Western blot法检测细胞中核因子-κB p65(NF-κB p56)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达情况，免疫荧光法检测细胞中NF-κB p65、磷酸化核因子-κB p65(p-NF-κB p65)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达情况，实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测细胞中NF-κB p65、Bcl-2、Caspase-3mRNA表达情况。(2)将HCT116细胞皮下注射于裸鼠腋下，建立大肠癌皮下移植瘤模型，然后将16只裸鼠随机分为对照组(PBS灌胃)、CET组(CET尾静脉注射，15 mg·kg-1)、ZJW+CET组(CET尾静脉注射，15 mg·kg-1;ZJW灌胃，2 055 mg·kg-1)、ZJW组(ZJW灌胃，2 055 mg·kg-1)，每组4只，连续干预28 d，绘制肿瘤生长图，28 d后剥离肿瘤组织，RT-qPCR法检测皮下移植瘤组织NF-κB p65、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达情况。结果 (1)ZJW在HCT116细胞中的IC10为10.71 mg·L-1;CET抑制HCT116增殖的IC50为578.6 mg·L-1，与10 mg·L-1左金丸联合使用时IC50值降低为231.3 mg·L-1;CET 100、200 mg·L-1与ZJW 5、10 mg·L-1联合使用时，药物联合指数(CI)<1。(2)与对照组相比，ZJW组、ZJW+CET组细胞S期比例、早期凋亡率升高(P<0.05)；与CET组相比，ZJW组细胞S期比例、早期凋亡率升高(P<0.05)；与ZJW组相比，ZJW+CET组S期细胞比例、早期凋亡率升高(P<0.05)。(3)与对照组比较，CET组、ZJW组细胞中Bcl-2表达降低(P<0.05),ZJW组细胞中Caspase-3表达升高(P<0.05),ZJW+CET组细胞Bcl-2、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达降低(P<0.05)；与CET组相比，ZJW+CET组细胞中Bcl-2、NF-κB p65、pNF-κB p65表达降低(P<0.05),Caspase-3表达升高(P<0.05)；与ZJW组相比，ZJW+CET组细胞Bcl-2、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达降低(P<0.05),Caspase-3表达升高(P<0.05)。(4)与对照组相比，ZJW组、ZJW+CET组细胞Bcl-2、NF-κB p65 mRNA表达降低(P<0.05)；与CET组相比，ZJW组、ZJW+CET组细胞Bcl-2、NF-κB p65 mRNA表达降低(P<0.05)；与ZJW组相比，ZJW+CET组细胞Bcl-2、NF-κB p65 mRNA表达降低(P<0.05)。(5)相较于对照组、CET组，ZJW组、ZJW+CET组裸鼠瘤体生长较为缓慢。给药28 d后剥离瘤体，与对照组相比，ZJW组、ZJW+CET组裸鼠皮下移植瘤体积缩小(P<0.05)；与CET组相比，ZJW、ZJW+CET组裸鼠皮下移植瘤体积缩小(P<0.05)；与ZJW组比较，ZJW+CET组裸鼠皮下移植瘤体积缩小(P<0.05)。(6)与对照组相比，ZJW组、ZJW+CET组瘤体组织中NF-κB p65、Bcl-2 mRNA表达降低，Caspase-3 mRNA表达升高(P<0.05)；与CET组相比，ZJW组瘤体组织中Caspase-3 mRNA表达升高(P<0.05)；与ZJW组相比，ZJW+CET组瘤体组织中Caspase-3 mRNA表达升高(P<0.05)。结论 ZJW可通过抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡等途径逆转KRAS突变大肠癌细胞对CET的耐药，继而抑制大肠癌生长，其机制可能与调控NF-κB/Bcl-2/Caspase-3通路相关。
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单位上海市第一人民医院; 宁波市第二医院; 上海中医药大学附属曙光医院
