EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定

作者：陈云; 周锋; 孙倍成; 刘根焰; 王冰; 姚堃

来源：细胞与分子免疫学杂志, 2009, 25(11): 1013-1015+1019.

DOI：10.3321/j.issn:1007-8738.2009.11.015

• EB病毒
• LMP2A
• 逆转录病毒
• 重组

目的:克隆EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)全长基因,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A,转染真核细胞后获得稳定表达LMP2A的细胞株。方法:采用RT-PCR技术从B95.8细胞中获得EB病毒LMP2A全长基因,克隆到测序载体pMD18-T中,经测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pGEZ-Term中,与两辅助病毒载体PHIT456、PHIT60通过Lipofectamine2000共转染包装细胞293T,测定产生的重组逆转录病毒滴度并感染小鼠成纤维细胞L929,经Zeocine筛选后得到稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western blot法检测细胞中LMP2A mRNA和蛋白表达情况。结果:重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A经测序鉴定正确;转染后上清中病毒的滴度为5×108cfu/L,感染L929细胞后用Zeocine筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Westernblot检测结果表明筛选出的细胞克隆能稳定表达EBV-LMP2A。结论:表达EBV-LMP2A细胞株的构建为蛋白制备与纯化奠定了物质基础,也为后续的EBV相关性疾病疫苗的研究提供了新思路。

• 单位
  南京医科大学; 南京医科大学第一附属医院