结核分枝杆菌实时荧光重组酶介导的等温扩增检测方法的建立与应用

作者：刘园园; 任卫聪; 薛仲探; 王伟; 张旭霞; 姚丛; 尚媛媛; 李姗姗; 逄宇^*

来源：中国医学前沿杂志(电子版), 2023, 15(08): 18-4.

DOI：10.12037/YXQY.2023.08-03

• 结核分枝杆菌
• 重组酶介导的等温扩增
• 荧光定量PCR
• 快速检测

目的 由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的结核病(tuberculosis,TB)是全球第二大单一感染致死病因,快速和准确的结核诊断技术有助于对其进行精准防控。方法 针对MTB菌株插入序列IS6110高度保守区域设计引物和exo探针并进行筛选,建立了MTB实时(real-time,RT)荧光重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法。通过检测11种非结核分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌评价RT-RAA方法的特异性。以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR)方法作为平行对照,应用RT-RAA方法扩增梯度稀释的含有目的基因序列不同拷贝数的重组质粒p EASY-Blunt-IS6110,以评价RT-RAA方法的检测敏感度和重复性。将建立的MTB RT-RAA方法应用于173份肺结核临床样品检测中,同时与q PCR方法进行比较。结果 建立的MTB RT-RAA方法在42℃条件下30min内即可完成反应;与非结核分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌均无交叉反应;最低检测模板质粒浓度为116拷贝/2μl,优于q PCR方法 (138拷贝/2μl);组内和组间的变异系数均小于8%,重复性好。对于肺结核临床样品的检测,RT-RAA方法检测的阳性率与q PCR方法差异无统计学意义。结论 本研究建立的MTB RT-RAA方法是一种方便、灵敏和低成本的MTB快速检测方法,具有良好的应用前景。

• 单位
  首都医科大学附属北京胸科医院; 北京市结核病胸部肿瘤研究所