胎鼠原代脊髓神经元分离培养方法的改良

作者：蓝文彬; 魏国桢; 王发圣; 吴贵; 郑力峰; 谢昀^*

来源：中国脊柱脊髓杂志, 2023, 33(01): 70-78.

• 脊髓神经元
• 原代培养
• 酶消化法
• Accutase酶法

目的：介绍一种改良原代胎鼠脊髓神经元的分离培养方法。方法 ：取育龄期雄、雌SD大鼠各36只，合笼配种怀孕。取受孕10～12d、13～15d及16～18d的SD大鼠各6只，解剖分离胚胎脊髓，按常规胰酶消化法制备单细胞悬液，应用细胞计数板及台盼蓝染色，在显微镜下数出蓝色细胞数和细胞总数，计算细胞存活率，明确最佳取材胎龄；接着以上述最佳取材胎龄为取材时间点，每组6只孕鼠，按无酶法、胰酶法和Accutase酶法消化三种不同的方法制备单细胞悬液，显微镜下数出蓝色细胞数和细胞总数，计算细胞存活率。接种、纯化细胞并培养1、3、7d后，用倒置相差显微镜观察脊髓神经元生长状态，利用神经元特异性标志物β tubulinⅢ与细胞核双标记法鉴定培养脊髓神经元的纯度。结果：孕13～15d组细胞总量和存活细胞量高于孕10～12d组，细胞存活率高于孕16～18d组（P<0.05）。Accutase酶组获取的细胞总量、存活细胞量以及细胞存活率均明显高于常规无酶组及胰酶组（P<0.05）。在倒置相差显微镜下观察发现，脊髓神经元培养7d后，胞体周围逐渐出现光圈，神经突起逐渐伸长，最终形成密集的神经突起网络；与无酶组及胰酶组相比，Accutase酶法分离的脊髓神经元分布更加均匀并且神经突起形成的网更密集。经β tubulinⅢ和hoechst33342荧光染色鉴定，Accutase酶组、无酶组及胰酶组三组分离提取培养的脊髓神经元纯度分别为（90.29±2.55）%、（83.51±6.20）%和（88.10±4.07）%，组间无统计学差异（P>0.05）。结论：13～15d胎龄是原代培养脊髓神经元的最佳取材时间；Accutase酶法相较于常规无酶法、胰酶法所获取的脊髓神经元产量更大、生长状态更好，可作为体外研究脊髓神经元病变的细胞模型。

• 单位
  福建医科大学附属第一医院