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摘要
目的 表达田鼠巴贝虫重组肽基脯氨酸异构酶（BmPPIase）基因并分析其功能。方法 利用生物信息学方法筛选分析BmPPIase基因信息。通过BmPPIase全基因合成获得目的片段BmPPIase，构建重组质粒pET28a-BmPPIase，转入大肠埃希菌BL21感受态细胞中进行原核表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析BmPPIase重组蛋白表达情况，镍柱亲和纯化重组蛋白，小牛血清蛋白（BSA）法测定重组蛋白浓度。取BmPPIase重组蛋白在新西兰白兔背部多点免疫4次（第1、15、29、43天，每次1.5 mg），首次免疫后第53天颈动脉采血，ELISA鉴定其特异性多克隆抗体效价。蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析多克隆抗体的免疫原性。免疫荧光定位实验判断PPIase在田鼠巴贝虫虫体的位置。体外抑虫实验分别设置BmPPIase重组蛋白终浓度500、250、100、50、10μg/ml组，以及重组剪接因子1组（无关蛋白对照组，500、250、100、50、10μg/ml）、BSA组、空白对照组，各组加入小鼠感染红细胞孵育48 h，经溴化乙锭标记后，采用流式细胞仪检测感染红细胞的比例，分析重组蛋白在田鼠巴贝虫感染宿主红细胞过程中的作用。结果生物信息学分析结果显示，BmPPIase为亲环素类PPIases；在牛巴贝虫、泰勒虫、人芽囊原虫、疟原虫中均存在同源蛋白。重组质粒酶切结果显示，插入的基因大小为531 bp，与预期相符，测序结果正确。SDS-PAGE分析结果显示，BmPPIase重组蛋白为可溶性蛋白，相对分子质量为19 000，经纯化后获得蛋白浓度为1.5 mg/ml。ELISA检测结果显示，抗BmPPIase重组蛋白特异性多克隆抗体效价> 1∶80 000。Western blotting分析结果显示，制备的抗BmPPIase多抗可特异识别重组蛋白。免疫荧光定位实验结果显示，BmPPIase分布在田鼠巴贝虫虫体表面，属于分泌蛋白。体外抑虫实验结果显示，重组BmPPIase对虫体入侵小鼠红细胞存在一定程度的抑制作用：BmPPIase重组蛋白浓度为500μg/ml时，相对染虫率为（47.0±1.2）%；随着重组蛋白浓度的降低，抑虫作用逐渐减弱，250、100、50μg/ml时相对染虫率分别为（64.0±0.3）%、（78.0±1.9）%和（82.0±0.25）%；至10μg/ml时相对染虫率为（93.0±0.22）%，已无明显抑虫作用。结论 BmPPIase属于分泌蛋白，分布于虫体表面；可在体外明显抑制田鼠巴贝虫感染红细胞。
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