骨化三醇对脂多糖诱导猪主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响

作者：谢贤锋; 胡文平; 施琼; 蒋迎九^*

来源：第三军医大学学报, 2018, 40(19): 1770-1776.

DOI：10.16016/j.1000-5404.201804038

• 钙化性主动脉瓣膜病
• 瓣膜间质细胞
• 成骨分化
• 骨化三醇

目的探究骨化三醇[1α,25-dihydroxycholecalciferol,1,25 (OH)2D3]对脂多糖(Lipopoly saccharide,LPS)诱导猪主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响,为钙化性主动脉瓣膜病的预防提供理论依据。方法 6只雄性健康家猪(8～10月龄,体质量100～120 kg),处死后即刻于无菌条件下取主动脉瓣叶。胶原酶连续消化法分离主动脉瓣膜间质细胞,观察其形态特征,并用免疫荧光染色行表型鉴定。利用条件培养基诱导细胞成骨分化,建立体外主动脉瓣膜间质细胞钙化模型,并予加入不同浓度骨化三醇处理72 h,并设立空白对照组和DMSO载体对照组。LPS诱导细胞成骨分化,筛选最适LPS效应浓度;实验分:空白对照组,骨化三醇组,LPS组,骨化三醇+LPS组。1 nmol/L骨化三醇与100 ng/mL LPS先后共同处理细胞48 h。分别用实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞成骨分化标志物骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)、骨钙蛋白(osteocalcin,OC)的mRNA和蛋白水平表达;茜素红染色评估晚期钙结节形成情况。结果成功分离出原代猪主动脉瓣膜间质细胞,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及波形蛋白(vimentin)染色阳性,血管性血友病因子(vWF)染色阴性。骨化三醇抑制条件培养基诱导的细胞成骨分化,BMP-2和OC的表达较空白对照组和DMSO载体对照组均显著降低(P <0. 05)。LPS处理后可促进细胞成骨分化,与其他浓度LPS组比较,其中100 ng/mL LPS组,BMP-2和OC的表达量最多(P <0.05);加入骨化三醇预处理后,可减弱LPS诱导的细胞成骨分化标志物表达,骨化三醇+LPS组BMP-2(n=3,1.94±0.27、0.41±0.03)和OC(n=3,0.21±0.04、0.44±0.03)的表达较LPS组(2.54±0.36、0.88±0.02;2.49±0.53、0.86±0.02)明显降低(P<0.01),并且晚期钙结节形成减少。结论骨化三醇可抑制条件培养基及LPS诱导的主动脉瓣膜间质细胞成骨分化,可能对主动脉瓣膜钙化具有一定的保护作用。

• 单位
  重庆医科大学; 重庆医科大学附属第一医院