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摘要
目的构建起搏基因质粒pIRES2-EGFP-mHCN2并转染到大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),检测其在MSCs中核酸和蛋白水平是否表达。方法采用密度梯度离心法分离获得MSCs。EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pGH-mHCN2和pIRES2-EGFP,回收目的片段,T4DNA连接酶连接。转化筛选阳性菌落,酶切和测序鉴定mHCN2是否插入pIRES2-EGFP中。脂质体转染质粒pIRES2-EGFP-mHCN2至MSCs,荧光显微镜下鉴定,并采用RT-PCR方法和Western blot方法分别检测转染质粒pIRES2-EGFP-mHCN2对mHCN2 mRNA和蛋白表达的影响。结果酶切鉴定和测序结果均证明mHCN2片段插入质粒pIRES2-EGFP。荧光显微镜下可见转染了质粒的MSCs发出绿色荧光。已转染质粒MSCs的mHCN2 mRNA的平均相对表达量是未转染MSCs的5.31倍(P<0.05),mHCN2蛋白是未转染MSCs的7.55倍(P<0.05)。结论成功构建质粒pIRES2-EGFP-mHCN2,证明了目的基因mHCN2在MSCs中mRNA和蛋白均有表达,为进一步研究生物起搏器奠定了基础。
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