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摘要
背景研究发现巨噬细胞及其分泌的趋化因子与角膜新生血管(CNV)的发生相关。巨噬细胞具有异质性,在不同的微环境以及不同的刺激条件下发挥不同的作用。目的检测C-X3-C趋化因子配体1(CX3CL1)和C-C趋化因子配体2(CCL2)对巨噬细胞增生的作用,并探讨其意义。方法 78周龄雄性BALB/c小鼠20只,用角膜碱烧伤的方法构建左眼CNV模型,术后4 d在裂隙灯显微镜下检查小鼠CNV情况,颈椎脱臼法处死小鼠并制备角膜切片。用荧光免疫组织化学法检测小鼠角膜组织中巨噬细胞表面两种趋化因子受体C-C趋化因子受体2(CCR2)和CX3CR1的表达。用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,在含质量分数10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中加入30μg/L粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF),诱导和培养人外周血单核细胞来源的巨噬细胞。将培养的细胞分为CD68+CCR2组和CD68+CX3CR1组,分别加入CD68+CCR2抗体和CD68+CX3CR1抗体,每组2管,其中一管作为IgG同型对照。采用流式细胞仪分别检测小鼠碱烧伤角膜组织中巨噬细胞和人外周血巨噬细胞中CX3CR1以及CCR2的表达。分别用人重组CX3CL1和CCL2蛋白刺激巨噬细胞,实时定量PCR(real-time PCR)法检测干预后巨噬细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶1(ADAMTS-1)、凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)等血管生成相关因子的表达。结果角膜碱烧伤后4 d,裂隙灯显微镜下可见角膜局部有新生血管发生,CNV沿角膜缘向角膜中心区域延伸。荧光免疫组织化学法检测发现,角膜组织内有F4/80阳性的巨噬细胞浸润,其表面可见CCR2和CX3CR1分子的表达,呈绿色荧光。未受GM-CSF诱导培养的巨噬细胞能维持生长约2周,但死亡细胞较多,而经GM-CSF诱导培养的细胞生长稳定,细胞数量增加,无明显悬浮死亡现象。培养的巨噬细胞中CX3CR1表达率平均约为75%,CCR2表达率为45%。Real-time PCR法检测发现,CCL2干预后巨噬细胞中VEGF mRNA的相对表达量明显增加,其中150 mg/L CCL2组VEGF mRNA的相对表达量明显高于对照组,差异有统计学意义(t=-5.09,P=0.03),而ADAMTS-1 mRNA、TSP-1 mRNA表达下降,其中150 mg/L CCL2组ADAMTS-1 mRNA、TSP-1 mRNA表达明显低于对照组,差异有统计学意义(t=3.01,P=0.04;t=4.27,P=0.02)。CX3CL1干预后巨噬细胞中VEGF mRNA表达量明显下降,而ADAMTS-1mRNA、TSP-1mRNA的表达水平升高,与对照组相比,150 mg/L CX3CL1组VEGF mRNA表达量下降,ADAMTS-1 mRNA、TSP-1mRNA表达量下降,差异均有统计学意义(t=6.35,P=0.02;t=-2.92,P=0.04;t=-3.81,P=0.03)。结论 CCL2、CX3CL1能通过其对应受体影响巨噬细胞VEGF、ADAMTS-1、TSP-1等血管新生相关因子的表达,提示通过CCL2、CX3CL1等干预靶点治疗新生血管性眼病的可能。
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单位苏州大学附属第一医院
