限制性内切酶Bsa I的分离纯化与结晶及其硒代衍生物的制备

作者：朱海; 郑梦泽; 贾玮玮; 周倩; 谈帅; 刘子昂; 张传志; 王伟玲; 李婷婷^*

来源：食品工业科技, 2023, 44(22): 110-116.

DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2022110215

• 限制性内切酶
• 表达纯化
• 硒代
• 结晶

目的：筛选并优化限制性内切酶Bsa I的三维结构样品制备的方法。方法：本课题采用大肠杆菌表达系统表达Bsa I蛋白及其硒代衍生物。首先构建重组表达载体pBAD-Bsa I，转化到大肠杆菌（E. coli）ER2566中进行表达，并采用亲和层析和阴离子交换层析进行纯化。然后利用质谱、圆二色谱的方法测试硒代蛋白衍生情况，并对其进行酶活测定。最后采用坐滴法进行初步的晶体生长研究。结果：通过两步纯化方法获得了纯度大于90%的重组Bsa I和Se-Bsa I硒代蛋白；经质谱检测发现重组Se-Bsa I蛋白中的11个甲硫氨酸全部硒代，圆二色谱检测和酶活测试确定了硒代对Bsa I蛋白的结构和活性无明显影响。结晶实验显示重组Bsa I蛋白不仅可以在0.2 mol/L酸镁四水合物、pH6.5的0.1 mol/L二甲胂酸钠三水合物、20%聚乙二醇8000的条件下生长出颗粒状结晶，而且可以在pH4.6的0.1 mol/L三水醋酸钠、2 mol/L硫酸铵的条件下生长出球状结构晶体。结论：本研究成功实现了BsaI蛋白及其硒代蛋白的重组表达，并对蛋白晶体条件进行初筛，旨为解析BsaI蛋白三维结构提供一定的参考。