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摘要
目的探讨肝癌细胞内质网应激相关外泌体能否通过Toll样受体4(TLR4)调控巨噬细胞M2极化及潜在机制。方法采用Western blot实验分析肝癌组织和衣霉素刺激后肝癌细胞内质网应激相关标志蛋白GRP78的表达及肝癌细胞分泌的外泌体鉴定;免疫组化检测肝癌组织GRP78的表达水平;免疫荧光验证巨噬细胞有效摄取外泌体;流式细胞术、Western blot实验和CBA试剂盒检测巨噬细胞M2型表型转化相关标志分子及巨噬细胞Toll样受体4表达水平;通过Affymetrix基因芯片和生物信息学分析筛选内质网应激相关外泌体作用后巨噬细胞mRNA的差异表达及TLR4的表达。结果临床样本中,肝癌组织GRP78表达高于癌旁组织。在细胞实验中,与对照组相比,2.5μmol·L-1的衣霉素刺激肝癌细胞24 h可明显升高内质网应激标志蛋白GRP78表达。衣霉素刺激和未刺激的肝癌细胞分泌的外泌体均特异性表达CD63、TSG101、HSP70外泌体标志性蛋白,但不表达外泌体阴性蛋白Calnexin。处理组肝癌细胞分泌的外泌体中HSP70表达高于对照组。激光共聚焦显微镜提示巨噬细胞可有效摄取外泌体,流式细胞术和Western blot进一步提示肝癌细胞ERS相关外泌体可显著上调巨噬细胞CD206、转化生长因子β1 (TGF-β1)和精氨酸酶1(Arg-1)的表达。此外,这些外泌体可以促进巨噬细胞分泌IL-6和IL-10,并上调巨噬细胞TLR4表达。结论内质网应激的HCC细胞可能通过释放富含HSP70的外泌体,激活TLR4信号,促进巨噬细胞M2极化。
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