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摘要
目的建立基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术的功能基因标签标记方法。方法通过分子无缝克隆技术构建Cas9核酸酶表达载体、DCAF12基因特异的sgRNA表达载体以及双剪切型供体DNA载体;将上述质粒共同转染肺癌细胞A549,用嘌呤霉素抗性基因作为选择标记进行筛选。联合RNA干扰和Western blot技术鉴定DCAF12基因是否被HA标签正确标记;后续用Cre重组酶切除胞内选择标记,并通过PCR和Western blot技术确认;最后通过细胞增殖试验和克隆存活试验鉴定DCAF12基因标记对重组细胞生长的影响;用HA抗体进行免疫共沉淀试验,检测HA-DCAF12蛋白是否与胞内cullin-4-RING泛素连接酶(CRL4)复合体相关蛋白结合。结果 RNA干扰和Western blot技术证实肺癌细胞DCAF12基因能够被HA标签表位正确标记;胞内选择标记被剔除后,能够避免对内源DCAF12基因表达的影响。细胞增殖与克隆存活试验证实DCAF12基因被HA标签标记后没有影响细胞生长;免疫共沉淀试验证实HA-DCAF12蛋白能够与CRL4复合体中的cullin-4A及DDB1蛋白相结合,提示DCAF12基因经HA标签标记后并未影响其自身生物学功能。结论本研究以肺癌细胞DCAF12基因为例,成功建立一种通过表位标签简便、快捷标记功能基因的技术方法。
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