靶向EphB4的慢病毒干扰载体对结肠癌细胞中EphB4及EphrinB2表达的影响

作者：张锦; 夏秋媛; 王建东; 周晓军

来源：医学研究生学报, 2014, 27(10): 1011-1015.

DOI：10.16571/j.cnki.1008-8199.2014.10.023

• Eph B4
• Ephrin B2
• 结肠癌
• 慢病毒载体
• RNA干扰

目的有研究显示Eph B4在肿瘤发生发展中的作用与其配体Ephrin B2密切相关。文中主要通过慢病毒介导的RNA干扰技术干扰结肠癌细胞中Eph B4基因的表达,观察Eph B4基因表达改变对其配体Ephrin B2表达的影响。方法根据Eph B4基因序列设计并合成3对miRNA的oligo DNA,退火形成双链后与pc DNA6.2-GW/Em GFP-miRNA载体相连并瞬时转染HEK293细胞,通过荧光显微镜、q PCR筛选出干扰效率最高的质粒,将其与中间载体p DONR221和慢病毒载体p Lenti6/V5-DEST连接构建慢病毒表达载体p Lenti6/V5-DEST-Eph B4。用脂质体将慢病毒载体以及包装质粒(p LP1、p LP2和p LP/VSVG)共转染293FT细胞,收集上清Lenti-miR-Eph B4感染HEK293细胞株进行滴度鉴定。将获得的病毒液感染人结肠癌细胞株,通过荧光显微镜和q PCR检测结肠癌细胞中Eph B4及其配体Ephrin B2的表达变化。结果测序结果表明3对干扰载体SR1、SR2、SR3序列与参考序列一致,成功转染HEK293细胞后,各转染组细胞荧光显微镜下均可见到绿色荧光蛋白表达;q PCR显示载体SR-3的沉默效率最高;构建出来的慢病毒载体p Lenti6.3/V5-DEST-miR-Eph B4在293FT细胞中包装成功,所得慢病毒滴度为7×108TU/m L;Lenti-miR-Eph B4浸染后,SW480和Caco-2中Eph B4 mRNA相对表达量(0.49±0.02、0.62±0.04)均较原始SW480(1.00±0.00)和Caco-2降低(1.00±0.00),差异有统计学意义(P=0.000);SW480中Ephrin B2 mRNA表达量F(2.11±0.04)较原始SW480(1.00±0.00)明显升高(P=0.000);而Caco-2细胞中Ephrin B2 mRNA表达无明显改变(1.01±0.02),差异无统计学意义(P=0.315)。结论靶向Eph B4的慢病毒干扰载体能够有效降低SW480及Caco-2细胞中Eph B4 mRNA表达水平。Eph B4与其配体Ephrin B2之间的相互作用可能受到多种因素调控,有待后续深入研究。

• 单位
  南京军区南京总医院