羊口疮病毒PMA-PCR检测方法的建立

作者：梁倩; 包涛涛; 鲜思美^*; 杨倩; 李鹏飞; 顾庆林; 郑维豪; 杜鹏; 青成欣

来源：中国畜牧兽医, 2022, 49(04): 1524-1531.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2022.04.035

• 羊口疮病毒(OrfV)
• PMA-PCR
• 活性检测

【目的】为快速有效评估宿主动物体内及周围环境中的羊口疮病毒(Orf virus, OrfV)是否失活，本研究应用核酸染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide, PMA)联合PCR扩增技术，以F1L基因为靶向检测对象，旨在建立一种针对具有感染活性OrfV的PMA-PCR检测方法。【方法】将病毒悬液经不同温度相同时间的水浴处理，通过PCR确定病毒样本最佳的热灭活温度；分别设置PMA曝光时间梯度及浓度梯度，进一步对PMA的曝光时间和工作浓度等因素进行优化，确定有效区分具有感染活性OrfV和失活OrfV的PMA最佳处理条件；对所建立PMA-PCR方法进行特异性试验验证，并通过对不同数量比例的热灭活OrfV、活OrfV混合病毒悬液样本进行检测来验证该方法的敏感性。【结果】OrfV样本经60℃热水浴处理10 min即可被完全灭活；PMA与失活OrfV的DNA共价结合且溶液中游离PMA光解的最佳曝光时间为15 min;热灭活OrfV基因组扩增被完全抑制的最小PMA浓度为20μmol/L,活OrfV基因组扩增不受抑制的最大PMA浓度为35μmol/L;特异性试验结果表明，该方法检测活OrfV时出现阳性条带，而口蹄疫病毒(FMDV)、绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)的扩增结果均呈阴性；经PMA处理后，在不同数量比例的活、热灭活OrfV病毒悬液中检测到活OrfV的灵敏度为10-1.68 TCID50/0.1 mL。【结论】本试验成功建立了针对活OrfV的PMA-PCR检测技术，该方法特异性强、敏感度高，可为相关工作领域评估OrfV致病性提供技术参考。

• 单位
  贵州大学; 动物科学学院