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摘要
基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段，为了深入研究甘蔗梢腐病菌致病基因的功能，构建了梢腐病菌YN41菌株的基因敲除体系。本研究构建了基于线性DNA的同源重组基因敲除技术，融合PCR构建敲除盒即带有潮霉素基因标记的线性DNA融合片段，配置0.05 g·mL-1溶壁酶+0.01 g·mL-1崩溃酶的复合酶液28℃酶解3 h获得了高产量的原生质体，利用聚乙二醇（PEG）介导的原生质体的转化，PCR鉴定技术和酶切鉴定技术对转化子进行鉴定，荧光定量PCR分析和Southern Blot方法进一步对基因缺失突变体进行验证，生物学表型（菌落形态、生长速率、产孢量、生物量和致病力）验证了PK基因敲除体系的成功构建。28℃酶解3 h获得了2×10～7个·mL-1原生质体；对编码丙酮酸激酶的PK基因进行了基因敲除验证，获得了纯合敲除突变体；荧光定量PCR检测转录水平无表达；Southern Blot结果显示使用PK基因探针杂交，基因缺失突变体无条带，野生型杂交到目的条带；生物学表型验证了PK基因敲除突变体对比野生型菌丝色素加深，生长速率先慢后快、产孢量增加，致病力增强，成功构建了PK基因敲除突变体。甘蔗梢腐病菌YN41基因敲除体系的成功构建，为甘蔗梢腐病菌致病基因的功能研究提供了技术平台。
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单位广西大学; 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室
