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摘要
目的探讨微RNA(miR)-146a参与原发性痛风性关节炎发生的可能机制。方法①培养RAW264.7细胞,给予单钠尿酸盐(MSU)晶体刺激建立痛风炎症模型,经200 μm/ml的MSU晶体刺激后,分别在0、3、6、12 h时间点收集细胞及上清液,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR,TaqMan探针法)检测miR-146a,RT-qPCR检测:白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK)1、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6、NF-κB、IL-1β、TNF-α mRNA,ELISA检测培养上清液IL-1β浓度,蛋白质印迹法检测TRAF 6、NF-κB、IL-1β蛋白表达水平。②用Lipofectamine 2000将miR-146a模拟物(mimic)、miR-146a抑制物(inhibitor)及两者相应对照物分别转染至RAW246.7细胞,将其设置为miR-146a mimic组、miR-146a mimic对照组(mimic control)、miR-146a抑制物组、miR-146a抑制物对照组(inhibitor control),分别用200 μg/ml的MSU晶体刺激各组细胞6 h后,分别检测各组miR-146a、IRAK 1、TRAF 6、NF-κB、IL-1β mRNA和TRAF 6、NF-κB、IL-1β蛋白表达水平。采用SPSS 21.0统计软件进行分析,近似正态分布定量资料以±s描述,组间比较采用独立样本t检验和重复测量方差分析。结果① MSU晶体刺激RAW264.7细胞后,实验组在3、6、12 h miR-146a的表达水平较对照组降低(t=-10.234,-17.059,-26.204,P均<0.01),实验组在6、12 h IL-1β蛋白浓度表达水平较对照组升高(t=7.552,9.007,P<0.01);分别检测2组IRAK1、TRAF 6、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA的表达水平:刺激组在3、6 h IRAK 1、TRAF 6、NF-κB、IL-1β mRNA的表达水平较对照组升高(t=9.847,6.147,P<0.01;t=3.49,3.32,P<0.05;t=3.643,8.471,P<0.05;t=8.726,49.68,P<0.01),实验激组在3个时间点的TNF-α mRNA的表达水平均较对照组升高(t=4.691,11.115,12.816,P<0.01)。分别检测TRAF 6、NF-κB、IL-1β的蛋白表达水平:实验组6、12 h的TRAF6、NF-κB蛋白相对表达较对照组升高(t=8.052,8.119,P<0.01;t=22.454,5.845,P<0.01),实验组在3个时间点IL-1β蛋白表达较对照组均升高(t=18.561,4.74,8.432,P<0.01)。②转染后检测miR-146a mRNA表达,mimics组较mimics control组明显升高(t=31.769,P<0.01);inhibitor组较inhibitor control组明显降低(t=-4.22,P<0.05)。③ miR-146a mimic组经200 μg/ml MSU晶体刺激6 h后,mimic组IRAK1、TRAF6、NF-κB、IL-1β mRNA的表达水平较mimic control组均降低(t=-14.754,-21.201,-19.381,-17.323,P<0.01),TRAF6、NF-κB、IL-1β蛋白表达水平较mimic control组也降低(t=-3.137,-32.974,-18.789,P<0.05),inhibitor组结果正好相反。结论①过表达miR-146a可降低IRAK 1、TRAF 6、NF-κB、IL-1β表达,抑制MSU晶体介导的炎症,而抑制miR-146a表达可使炎症加重,提示miR-146a参与负反馈调节痛风炎症。② miR-146a可能靶向NF-κB信号通路参与了痛风性关节炎的自发性缓解。
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单位大坪医院; 川北医学院附属医院; 中国人民解放军陆军军医大学
