重组多杀性巴氏杆菌Dot蛋白诱导小鼠抗攻击感染的免疫保护效果研究

作者：王宇凤; 苏静明; 邵萌萌; 刘鑫; 黄复深^*

来源：中国预防兽医学报, 2023, 1-8.

• 多杀性巴氏杆菌
• dot基因
• 重组Dot蛋白
• 免疫保护效果
• 小鼠

为研究猪多杀性巴氏杆菌(Pm)毒力蛋白Dot的生物学特性及评估其诱导小鼠产生的免疫保护效果，根据GenBank登录的Pm CS株dot基因序列设计特异性引物1对，然后以A型Pm CS株基因组DNA为模板经PCR扩增dot基因片段，产物测序后利用生物信息学进行序列分析。结果显示，dot基因由729 bp组成，编码含242个氨基酸的膜蛋白；该蛋白的N端有一24个氨基酸组成的信号肽，具有重复sel 1结构域，属于四肽重复超家族；抗原表位分析显示，Pm Dot具多个抗原表位；序列同源性分析显示，不同血清型Dot蛋白的氨基酸序列的同源性达99%以上。将dot基因亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒pET-dot，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达的重组蛋白rDot采用His纯化柱纯化后，经SDS-PAGE检测并采用western blot鉴定。结果显示，r Dot表达正确，纯化效果好，具有较好的免疫原性。免疫保护实验，取40只4周龄BALB/c小鼠随机均分为5组，3个实验组分别于0、2、4周对小鼠通过背部皮下多点注射弗氏不完全佐剂(IFA)+10μg rDOT(低剂量组)、IFA+30μg r DOT(中剂量组)、IFA+50μg rDOT(高剂量组)。2个对照组分别注射等量生理盐水和弗氏不完全佐剂。小鼠于每次免疫前和感染前，尾静脉采血并分离血清，ELISA检测血清IgG抗体水平。第3次免疫后2周，通过腹腔注射10×LD50的A型Pm CS株攻击感染小鼠，观察攻毒后小鼠的临床症状及死亡情况。结果显示，生理盐水和弗氏不完全佐剂组小鼠，抗体水平未见显著差异；相较于对照组，实验组小鼠第3次免疫后的IgG抗体水平极显著高于对照组(P<0.01)。攻毒3 d后，对照组小鼠全部死亡，低剂量、中剂量、高剂量组小鼠存活率分别为12.5%(1/8)、50%(4/8)、62.5%(5/8)。随后，存活小鼠逐渐恢复并正常采食。本次研究表明，rDot蛋白具有很好的免疫原性，可诱导小鼠产生部分免疫保护力。该研究为Pm Dot亚单位疫苗的研究积累了基础资料。

• 单位
  湖南农业大学