ATP5B原核表达和单克隆抗体的制备及其鉴定

作者：李时孟; 赵丽纯; 乔璐; 何成彦; 刘卓^*

来源：吉林大学学报(医学版), 2019, 45(01): 184-220.

DOI：10.13481/j.1671-587x.20190135

• ATP合酶β亚基
• 单克隆抗体
• 原核表达
• 蛋白纯化

目的:制备高纯度ATP合酶β亚基(ATP5B)单克隆抗体并进行鉴定,为其后续研究奠定基础。方法:应用PCR法扩增ATP5B基因,克隆入pET28a载体中并转入大肠杆菌BL21 (DE3)。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达并用镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白纯度。用纯化的融合蛋白免疫3只雌性Balb/C小鼠,取小鼠尾静脉血,间接酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中ATP5B抗体效价。取血清效价最高的免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞混合培养建立杂交瘤细胞,采用间接ELISA法筛选融合细胞并行单克隆化培养,对阳性细胞进行核型分析。取12周龄Balb/C小鼠,腹腔注射杂交瘤细胞制备腹水模型,收集腹水,间接ELISA法检测效价,SDS-PAGE检测抗体纯度,应用ELISA法检测抗体亚型。结果:PCR扩增后得到1 455bp的特异性条带,连接pET28a空载体获得重组pET28a/ATP5B载体。IPTG诱导转化的菌液表达目的蛋白,SDS-PAGE检测,在相对分子质量为51 000处出现明显的诱导蛋白条带。间接ELISA法检测免疫小鼠静脉血,血清效价最高达1∶64 000。杂交瘤细胞染色体核型分析,染色体总数约为骨髓瘤细胞与正常小鼠脾细胞之和。采用杂交瘤细胞株制备小鼠腹水,抗体最高效价为1∶240 000,杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的亚型为IgG1。结论:通过克隆、表达和纯化重组蛋白,成功制备出抗ATP5B蛋白单克隆抗体。

• 单位
  吉林大学; 吉林大学中日联谊医院