牛冠状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

作者：高辉; 李晓成; 刘莹; 袁野; 张欣怡; 尼博; 张慧; 段纲^*; 董雅琴^*; 魏荣^*

来源：黑龙江畜牧兽医, 2022, (06): 86-91.

DOI：10.13881/j.cnki.hljxmsy.2021.09.0301

• 牛冠状病毒
• 小沟结合物(MGB)
• 实时荧光定量RT-PCR
• 检测方法
• 流行病学调查

为了建立一种敏感、特异的牛冠状病毒(BCoV)实时荧光定量RT-PCR检测方法，试验利用GenBank中BCoV参考毒株N基因序列，设计引物及小沟结合物(MGB)探针，建立实时荧光定量RT-PCR方法，对方法的特异性、灵敏度和稳定性进行检验。利用建立的方法对采集自7个省份31个发病牛场的925份临床样本进行检测，并用基于BCoV N基因的普通RT-PCR结合测序的方法对部分阳性样品进行验证。结果表明：建立的实时荧光定量RT-PCR方法的扩增体系为上下游引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)0.8μL,2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL,Ex Taq HS (5 U/μL) 0.4μL,Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μL,总RNA 2μL,ddH_2O 4.4μL;扩增程序为，42℃5 min; 95℃10 s; 95℃5 s, 55℃35 s, 40个循环。标准曲线方程为y=40.979-3.512x,可信度(R~2)为0.999,扩增效率(E)为92.6%,最低检测限为48 copies/μL,重复性变异系数(CV)不超过0.82%。31个发病牛场BCoV阳性场占比为64.52%(20/31),其中腹泻症状阳性场占比为54.55%(12/22),呼吸道症状阳性场占比为65.22%(15/23);阳性样品经基于BCoV N基因的普通RT-PCR方法验证，测序正确。说明建立的BCoV实时荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、稳定性好，能检测出临床样本中的BCoV核酸，可应用于BCoV感染的诊断、监测与流行病学调查。

• 单位
  中国动物卫生与流行病学中心; 天津市动物疫病预防控制中心; 云南农业大学