建立大鼠脊柱功能单位体外培养模型

作者：雷昌斌; 郭志文; 王炯; 林宏生; 唐新文^*; 李健^*

来源：广东医学, 2019, 40(21): 2979-2984.

DOI：10.13820/j.cnki.gdyx.20192087

• 脊柱退变
• 脊柱功能单位
• 体外培养

目的建立大鼠脊柱功能单位(functional spine unit, FSU)体外培养体系模型。方法选取8～12月龄雄性大鼠,用CO2安乐处死后,解剖大鼠脊柱胸椎和腰椎。保留一侧椎体骨质2 mm,另外一端紧贴椎间盘终板外缘切除,制作骨-椎间盘-骨结构FSU。将FSU用1%PBS清洗后,放入12孔板中并加入培养基连续培养28 d。在不同的时间节点(0、3、5、7、14、21、28 d)用MTT和DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)染色并冰冻切片分别检测椎间盘纤维环和髓核的细胞活性。提取不同时间点椎间盘髓核组织检测糖胺聚糖(glycosaminoglycan content, GAG)的差异性并做定量评估。Western blot检测不同时间点椎间盘组织聚糖蛋白聚糖降解碎片(aggrecan fragment)中衰老标志基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及血小板反应蛋白解整合素金属肽酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, ADAMTS)的表达差异。Q-PCR检测各组相关基因的表达。结果细胞活性检测显示,随着体外培养时间的延长,椎间盘纤维环细胞及髓核细胞活性下降。FSU体外培养7 d后出现髓核细胞(NP)活性明显下降,7 d后细胞活性下降为(58.62±2.77)%,差异有统计学意义(P<0.05),14 d细胞活性为(10.67±2.47)%,差异有统计学意义(P<0.05)。纤维环细胞(AF)相对比较稳定,呈现逐步下降的趋势,28 d后细胞活性仍为(74.01±0.63)%,差异有统计学意义(P<0.05)。GAG检测髓核0、3、5、7 d糖胺聚糖含量差异无统计学意义(P>0.05),但是除以单位含量的DNA后第5天和第7天比值明显升高(P<0.05)。Western blot检测椎间盘组织aggrecan fragment中的MMPs和ADAMTS含量随着培养时间延长出现升高,其中第7天与0 d相比差异有统计学意义(P<0.05)。Q-PCR检测椎间盘成分基因聚糖蛋白聚糖(aggrecan)及CollagenⅠ基因随着培养时间延长表达量减低,并且各组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠脊柱功能单位连续培养7 d后髓核细胞活性急剧降低,体外培养28 d纤维环细胞活性仍较稳定。

• 单位
  暨南大学附属第一医院; 湘南学院附属医院