miR-195真核表达载体的构建与生物信息学分析及其靶向PD-L1介导淋巴细胞增殖的实验研究

作者：罗小琴; 赵云; 刘朝奇; 邹云雷; 李晓晓

来源：医学研究生学报, 2021, 34(07): 691-697.

DOI：10.16571/j.cnki.1008-8199.2021.07.004

• miR-195
• 真核表达载体
• 生物信息学
• 淋巴细胞

目的目前在肝癌细胞中miR-195与PD-L1表达关系和作用机制尚不完全清楚。构建miR-195真核表达载体,研究其与肝癌细胞中PD-L1的关系及其对淋巴细胞增殖的影响,并通过生物信息学预测miR-195靶基因及其参与的信号通路。方法以正常宫颈脱落细胞DNA为模板,通过PCR对目的片段进行扩增,将真核表达载体pcDNA3.1(+)与目的片段分别连续单酶切、纯化、连接、送测序鉴定。用pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1-miR-195分别转染HepG2细胞和H22细胞48 h后,分别记为空白对照组、pcDNA3.1组和miR-195组,通过RT-PCR检测HepG2细胞中miR-195及PD-L1基因表达水平,流式细胞仪检测肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达,以及miR-195对淋巴细胞增殖的影响。实验分为4组:淋巴细胞组(L组),淋巴细胞+H22细胞组(L+T组),淋巴细胞+H22细胞+pcDNA3.1组(L+T+pcDNA3.1组)和淋巴细胞+H22细胞+pcDNA3.1-miR-195组(L+T+miR-195组),流式细胞术检测miR-195对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。利用在线数据库预测miR-195靶基因,并对靶基因集合进行KEGG通路富集分析。结果成功构建pcDNA3.1-miR-195真核表达载体,生物信息学预测PD-L1为miR-195的靶基因。RT-PCR结果提示与对照组和pcDNA3.1(+)组相比,pcDNA3.1-miR-195组中miR-195的表达量上调、PD-L1表达量下调(P<0.01)。流式细胞仪结果提示miR-195可降低肝癌细胞中PD-L1表达量(P<0.01),并可促进淋巴细胞增殖(P<0.05)。与L组(1.455±0.050)淋巴细胞比较,L+T组(1.280±0.141)和L+T+pc-DNA3.1组(1.240±0.424))增殖降低,差异具有统计学意义(P<0.05);L+T+miR-195(1.640+0.099)组与L+T组相比,淋巴细胞增殖增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。KEGG信号通路分析提示miR-195主要富集在PI3K-Akt、MAPK、Hippo和Wnt等信号通路。结论通过上调肝癌细胞中miR-195的表达量可靶向下调PD-L1表达,并促进淋巴细胞的增殖。通过对miR-195靶基因集合进行KEGG通路分析,为后续研究miR-195在肝癌发生、发展过程中的相关调控机制提供依据。

• 单位
  三峡大学