siRNA体外合成体系中GMP浓度优化及其对HeLa细胞端粒酶抑制的研究

作者：顾孔珍; 江涛; 樊冰; 罗建新; 彭剑雄

来源：实用预防医学, 2008, (03): 663-665.

• GMP
• T7RNA聚合酶
• siRNA
• 端粒酶
• TRAP银染

目的在小片段干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)体外合成的反应体系中加入不同浓度的GMP,比较RNA转录效率的高低,探讨siRNA体外合成体系中GMP的最佳浓度。并以该法合成的siRNA对肿瘤细胞端粒酶基因表达进行RNA干扰来验证其干扰效应。为简便、高效、低成本体外合成制备siRNA提供优化的实验条件,为广泛开展RNA干扰实验打下基础。方法以本实验室根据端粒酶hTERT基因(genebankgi:2347128)2653-2673位的核酸序列,构建的末端带T7启动子的部分双链DNA为模板,用T7RNA聚合酶体外合成方法合成siRNA。在siRNA体外合成的反应体系中加入不同浓度的GMP,以分光光度法测定合成的RNA量来比较RNA转录效率的高低;从而确定siRNA体外合成中GMP的最佳浓度。并以磷酸钙共沉淀法将合成的siRNA转染Hela细胞。用TRAP-银染法和PCR-EIA分别检测siRNA转染后的Hela细胞端粒酶活性,以验证其干扰效应。结果在T7RNA聚合酶体外转录合成siRNA的反应体系中加入不同浓度的GMP,结果显示以GMP终浓度为5mM时的RNA转录效率为最佳。用该法合成的siRNA转染Hela细胞后端粒酶表达被抑制。结论GMP可提高T7RNA聚合酶体外转录体系的转录效率,本实验研究的反应体系中以5mMGMP终浓度为其最佳。以该优化法合成的针对端粒酶hTERT的siRNA对端粒酶的表达产生了干扰效应。

• 单位
  中南大学湘雅医学院