新德里金属β-内酰胺酶-4的原核表达及酶活性研究

作者：沈秉正; 张玲莉; 祝成亮; 彭燕; 熊远果; 喻研^*

来源：中华生物医学工程杂志, 2019, (01): 1-6.

• 新德里金属β-内酰胺酶-4
• 原核表达
• 酶促反应动力学
• 酶活性

目的 利用生物工程技术原核表达新德里金属β-内酰胺酶-4(NDM-4),测定其水解底物的酶促反应动力学参数,并研究pH值及温度对酶活性的影响。方法 利用聚合酶链式反应技术扩增临床分离的携带blaNDM-4基因,扩增后克隆至pET30a载体,构建原核表达重组质粒,转化至E. coli BL21(DE3)中,测定工程菌对各类β-内酰胺类抗生素抗性后,利用工程菌E. coli BL21(DE3)-pET30a-NDM-4诱导表达NDM-4酶。过表达的重组酶用Ni2+柱纯化,经蛋白电泳及质谱鉴定后,测定其水解底物的酶促反应动力学参数及最适pH值和温度。结果 通过测序确定重组质粒pET30a-NDM-4序列正确,获得blaNDM-4基因的工程菌具对β-内酰胺类抗生素的抗性,过表达的重组酶相对分子质量约为28 400,纯化后蛋白浓度为0.4 g/L,该酶对包括碳青霉烯类几乎所有β-内酰胺类抗生素均具有较高水解活性,其最适pH值为7.5,最适温度为35 ℃。结论 利用原核表达系统成功过表达并获得具有高效水解β-内酰胺环活性的NMD-4酶,为深入研究其作用机制及酶学特性提供了物质基础。

• 单位
  华中科技大学同济医学院附属同济医院; 武汉大学人民医院