组氨酸6.52和酪氨酸7.43位点突变对μ阿片受体下游信号通路的影响

作者：田祥云; 孙毅; 邵帅; 刘晓倩; 谭博^*; 苏瑞斌^*

来源：中国药理学与毒理学杂志, 2021, 35(12): 904-912.

• μ阿片受体
• 氨基酸位点
• 突变
• 信号通路

目的研究在DAMGO和吗啡激活状态下,组氨酸6.52(H6.52)和酪氨酸7.43(Y7.43)位点突变对μ阿片受体(MOR)下游信号通路的影响及其潜在的分子机制。方法通过计算机模拟预测出H6.52和Y7.43位点参与MOR与配体的结合;在HEK 293T细胞上采用点突变方法构建H6.52亮氨酸(H6.52L)、H6.52天冬氨酸(H6.52D)、H6.52色氨酸(H6.52W)、Y7.43丙氨酸(Y7.43A)、Y7.43苯丙氨酸(Y7.43F)和Y7.43丝氨酸(Y7.43S)突变型MOR;采用荧光标记配体结合法测定DAMGO和吗啡与MOR的竞争结合;采用GloSensor技术测定细胞中环磷酸腺苷(cAMP)含量;采用蛋白相互作用体系测定β-制动蛋白2的招募。结果受体配体结合实验显示,荧光标记配体不能与H6.52突变型MOR结合,但可与Y7.43突变型MOR结合,对于Y7.43A,Y7.43F和Y7.43S突变体,DAMGO的抑制常数(Ki)值分别为2278±183,1023±99和(2956±364)nmol·L-1;吗啡的Ki值分别为1999±411,2011±467和(2221±413)nmol·L-1。cAMP含量测定实验结果显示,DAMGO作用于H6.52L,H6.52D,H6.52W,Y7.43A,Y7.43F和Y7.43S突变型MOR时,抑制cAMP生成的半数最大效应浓度(EC50)值分别为8320±1419,603±170,311±150,2635±176,230±11和(3109±189)nmol·L-1,均较其作用于野生型MOR[(2.08±0.27)nmol·L-1]时显著增大(P<0.01);吗啡作用于H6.52D和H6.52W突变体时,抑制cAMP生成的EC50值分别为2307±436和(33397±3000)nmol·L-1,较其作用于野生型[(148±57)nmol·L-1]时显著增大(P<0.01),作用于Y7.43A,Y7.43F和Y7.43S突变体的EC50值分别为399±176,105±8和(446±214)nmol·L-1,与其作用于野生型[(148±57)nmol·L-1]无显著性差异。β-制动蛋白2募集实验结果表明,DAMGO作用于野生型MOR后招募β-制动蛋白2的EC50值为(1184±112)nmol·L-1,作用于各突变型MOR后均不能招募β-制动蛋白2;吗啡作用于野生型和各突变型MOR后均不能招募β-制动蛋白2。结论 H6.52和Y7.43均是MOR下游信号通路激活的关键氨基酸位点,其中H6.52是DAMGO和吗啡与MOR结合的关键氨基酸位点,Y7.43是造成DAMGO和吗啡对MOR下游信号通路差异性的位点。

• 单位
  药物研究所; 南京中医药大学