利用CRISPR/Cas9技术构建DOC-1R基因敲除的HEK-293稳转细胞系

作者：王世全; 郭莹莹; 沈飞; 高锦兰; 邢雪莎; 王述森; 罗阳; 刘琦^*

来源：解剖科学进展, 2020, 26(03): 339-342.

DOI：10.16695/j.cnki.1006-2947.2020.03.026

• DOC-1R
• 基因敲除
• CRISPR/Cas9技术
• 慢病毒

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除人胚肾(human embryonic kidney cell,HEK-293)细胞中DOC-1R,构建DOC-1R敲除的HEK-293稳转细胞系,用于进一步讨论DOC-1R的生物学功能。方法根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),构建表达载体,对sgRNA测序并转染包装HEK-293T收集上清液测定病毒滴度。前期用Cas9-puro慢病毒感染HEK-293,用已制备的DOC-1R慢病毒感染稳转Cas9的HEK-293,72 h后显微镜下观察HEK-293表达红色荧光蛋白,并用Western blot检测HEK-293中DOC-1R的表达以确定沉默效果。结果测序显示插入的sgRNA序列正确,表达载体成功构建,显微镜下观察到,90%以上HEK-293表达红色荧光蛋白,HEK-293中DOC-1R蛋白表达减少,确定了DOC-1R敲除效果最明显的序列为GCCTACCTATGCTGGCAGCA。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建DOC-1R基因敲除的细胞系,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

• 单位
  中国医科大学; 生命科学学院