抗程序性死亡受体-1纳米抗体的制备及鉴定

作者：范利华; 马晓玲; 李江伟^*

来源：国际生物医学工程杂志, 2018, 41(03): 230-237.

• 程序性死亡受体-1
• 纳米抗体
• 重链抗体可变区
• 鉴定
• 噬菌体展示

目的制备能与程序性死亡受体-1(PD-1)抗原高亲和力结合的骆驼源纳米抗体,为后续开展其功能性研究提供实验基础。方法采用真核表达的PD-1-Fc重组蛋白对新疆双峰驼进行6次免疫,采集其外周血并从中分离得到淋巴细胞,进行巢式PCR扩增获取骆驼重链抗体可变区(VHH)基因,并构建噬菌体展示文库。然后采用固相酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选噬菌体展示文库,包被质量浓度依次降低(5.00、2.50、1.00μg/ml)的PD-1抗原于ELISA板中,对噬菌体展示文库进行3轮亲和淘选。接着采用可溶性单克隆ELISA法进一步筛选与PD-1结合的单个克隆。根据DNA测序结果挑选具有多次重复序列的3个VHH单克隆构建至pET22b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达。最后采用镍柱亲和层析纯化重组VHH抗体蛋白,蛋白质印迹法(Western Blot)和ELISA法检测其与PD-1抗原的结合活性和亲和力。结果采用重组蛋白PD-1-Fc对双峰驼免疫6次后,激发了高滴度的特异抗体,免疫血清效价达到1:32 000。从免疫后的骆驼淋巴细胞构建了库容大小为2.6×108 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库。经3轮亲和筛选后,采用可溶性单克隆ELISA法进一步筛选获得46个吸光度(A600)值在0.6以上的单个VHH克隆。其中VHH-B7、VHH-H5和VHH-H12三个克隆序列具有较高重复,表明获得了显著富集。Western Blot及ELISA法检测结果显示,纯化的B7、H5和H12纳米抗体均与PD-1抗原具有较好的结合活性,且具有较高的亲和力,亲和力常数分别为1.19×1011、1.63×1011、1.59×1011 L/mol。结论通过对VHH噬菌体展示文库进行亲和筛选,获得了能与PD-1抗原高亲和力结合的抗PD-1骆驼源纳米抗体,为后续开展其功能性研究提供了实验基础。