铜绿假单胞菌寡核苷酸酶的纯化、结晶和活性验证

作者：张建羽; 张琼林^*

来源：吉林大学学报(医学版), 2022, 48(05): 1124-1130.

DOI：10.13481/j.1671-587X.20220504

• 铜绿假单胞菌
• 寡核苷酸酶
• 3’,5’-环二鸟苷
• 蛋白纯化
• 晶体筛选

目的：研究致病菌铜绿假单胞菌寡核苷酸酶（PaOrn）的三维结构和体外水解活性，验证PaOrn活性位点并探讨PaOrn对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）胞内3’,5’-环二鸟苷（c-di-GMP）水平和致病毒性的影响。方法：构建重组质粒pET 32M3C-PaOrn，在大肠杆菌（E. coli） BL21中诱导表达目的蛋白，获得组氨酸（His）标签和谷胱甘肽（GST）标签标记。采用多级纯化方法纯化蛋白，经Ni亲和层析、GST亲和层析和阴离子交换层析后获得高纯度和高均一性PaOrn目的蛋白。采用商业化结晶试剂和坐滴法筛选晶体，根据晶体状态进一步优化。采用X射线衍射法验证晶体质量，分辨率高于3?时用于结构解析。采用高分辨质谱技术Q TOF验证PaOrn蛋白水解底物二鸟苷磷酸（pGpG）活性，鸟苷单磷酸（GMP）产物作为验证活性的指标。采用尿素聚丙烯酰胺（Urea-PAGE）法验证PaOrn蛋白和点突变PaOrn蛋白（OrnD11A、OrnE13A、OrnD111A、OrnH157A和OrnD162A）对10 nt长度寡核苷酸RNA的水解活性，降解条带作为活性正常的分析指标。结果：经原核系统表达和多级纯化，得到纯度高达95%的目的蛋白PaOrn。于结晶试剂WizardⅠ#12 [1.0 mmol·L-1(NH4)2HPO4,0.1 mmol·L-1Imidazole] pH 8.0条件下生长出质量较好的单晶，晶体PaOrn的分辨率为1.85?，复合物PaOrn-GMP和PaOrnD11A-pGpG的分辨率分别为1.90?和1.70?。高分辨质谱，PaOrn将底物pGpG水解为GMP。尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳，PaOrn可降解长达10 nt的RNA，当活性位点Asp11、Glu13、Asp111、His157和Asp162分别突变后，PaOrn丧失活性，无法降解底物pGpG和RNA(10 nt)。结论：PaOrn通过降解寡核苷酸参与调控胞内c-di-GMP和RNA水平，影响转录起始和细胞多种生物学行为。