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摘要
目的以纳米微泡超声造影剂作为基因治疗中小干扰RNA(siRNA)的载体,探讨纳米微泡搭载siRNA联合超声靶向破碎技术对siRNA的转染及干扰效率以及对抑制胶质瘤肿瘤细胞生长、提高肿瘤细胞凋亡水平的作用。方法薄膜水化法制备粒径均一的纳米微泡,通过生物素-亲和素系统连接纳米微泡和siRNA,对胶质瘤细胞进行转染。将细胞分为纳米微泡-羧基荧光素(FAM)-乱序阴性对照siRNA(scrambled siRNA,SCR)-超声辐照组(NB-FAM-SCR-US),纳米微泡-FAM-SCR-无超声辐照组(NB-FAM-SCR)和正常细胞组,利用激光共聚焦显微镜检测各组细胞siRNA的转染效率;将细胞分为纳米微泡-siRNA-超声辐照组(NB-siRNA-US),纳米微泡-siRNA-无超声辐照组(NB-siRNA),纳米微泡-SCR-超声辐照组(NB-SCR-US),实时荧光定量PCR(Real-time PCR)及蛋白质免疫印迹(Western blot)检测各组细胞siRNA对目的基因的干扰效率;CCK-8及Annexin-V检测各组肿瘤细胞的活性及细胞凋亡率。结果通过薄膜水化法制备的纳米微泡平均粒径为(663.9±102.5)nm,纳米微泡-siRNA的平均粒径为(707.0±127.6)nm。激光共聚焦显微镜检测发现,与NB-FAM-SCR组相比,NB-FAM-SCR-US组可在细胞核(蓝色荧光)周边观测到更多的绿色荧光,正常细胞组仅可观测到细胞核的蓝色荧光,未见绿色荧光。Real-time PCR检测发现,与NB-SCRUS组相比,NB-siRNA-US组和NB-siRNA组IDH1基因的表达在mRNA水平均降低,差异具有统计学意义(t=-20.35、-4.27,P均<0.01);而NB-siRNA-US组目的基因表达降低更为显著,与NBsiRNA组相比,差异具有统计学意义(t=-12.34,P <0.01)。Western blot检测发现,与NB-SCRUS组和NB-siRNA组相比,NB-siRNA-US组的IDH1基因表达水平明显减低。CCK-8及Annexin-V检测各组细胞活性及细胞凋亡率,结果显示与NB-siRNA组和NB-SCR-US组相比,NB-siRNA-US组的细胞活性明显减低,细胞凋亡率明显增高,差异有统计学意义(CCK-8组:t=-13.52,-31.55,P<0.01;Annexin-V组:t=8.30、9.79,P <0.01)。结论纳米微泡搭载siRNA联合超声靶向破碎技术,能有效提高siRNA的转染及干扰效率,可抑制肿瘤细胞生长,为胶质瘤的非侵入性治疗提供了新思路。
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单位唐都医院; 中国人民解放军空军军医大学
