科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的筛查细胞质基质中组蛋白H2A变体macro H2A的分子伴侣,借此研究macro H2A在分子伴侣的协助下进入细胞核的分子机制。方法建立在羧基末端表达融合有Flag标签的macro H2A-HCD(histone core domain)(a.a.21161)的He La S3稳定细胞系。大规模悬浮培养细胞并利用低渗处理膨胀细胞、匀浆、离心,分离得到细胞质基质。透析后,通过免疫共沉淀技术获得macro H2A-HCD蛋白复合物,利用质谱技术鉴定macro H2A-HCD蛋白复合物的成分,分析质谱数据筛选macro H2A分子伴侣。结果通过PCR扩增macro H2A-HCD DNA片段,并将之连入感染用载体p WPXL-C1-Flag。酶切、测序鉴定正确的p WPXL-macro H2A-HCD-C1-Flag质粒经包装转染HEK293T产生的慢病毒,对He La S3进行感染。通过Western blot法及免疫荧光实验,证明稳定表达羧基末端融合Flag标签的macro H2A-HCD的He La S3细胞系构建成功。悬浮培养后收集的细胞,经过低渗溶液处理后体积膨胀为原来体积的2倍,经匀浆、离心,匀浆液自上而下依次分为4层,分别为脂膜层、细胞质基质层、细胞器层、核层,最后获得纯净的细胞质基质。细胞质基质中加入Flag-M2珠子,经过免疫共沉淀实验得到蛋白复合物。经质谱分析后发现,复合物中含有macro H2A-HCD及多种已知的分子伴侣。结论细胞质基质中的macro H2A可能在多种分子伴侣的协助下进入细胞核。
- 单位
