科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
为筛选与非洲猪瘟病毒（ASFV）引物解旋酶C962R互作的病毒蛋白，本研究将ASFV Pig/HLJ/2018株感染猪肺泡巨噬细胞（PAM）后20 h内每间隔2 h收获细胞，通过荧光定量PCR检测C962R基因的动态转录水平。结果显示，ASFV感染PAM后6 h C962R基因的转录水平明显增加，18 h达峰值。经PCR扩增质粒pmCherry的mCherry基因、ASFV基因组中距C962R基因起始密码子41 bp（内含子部分）处上游约1 000 bp的基因序列、距C962R N端约1 000 bp的基因序列（该N端融合Strep标签）及C962R基因起始密码子上游的41 bp（内含子部分）基因序列后，构建重组质粒p3X-MCS-C962R-mCherry，并经双酶切鉴定正确后转染PAM，采用Pig/HLJ/2018株感染该PAM,48 h后分别收获上清液和细胞，采用PCR和western blot鉴定获得的重组病毒。结果显示，上清液中出现约1 000 bp的包含mCherry和Strep标签的基因片段及PAM中出现100 ku的特异性条带，表明获得了融合表达C962R蛋白和Strep标签的重组ASFV(rC962R-mCherry)。将慢病毒包装质粒和辅助质粒共转染HEK 293T细胞，利用嘌呤霉素筛选融合表达C962R蛋白和Strep标签蛋白的细胞并经western blot鉴定。结果显示，细胞中出现100 ku的特异性条带，表明获得了表达ASFV C962R蛋白的细胞PK-15-C962R-Strep。分别将rC962R-mCherry感染PAM、ASFV Pig/HLJ/2018株感染PK-15-C962R-Strep，通过这两种感染方式经Strep pull-down试验检测C962R蛋白及筛选与其互作的病毒蛋白，并经质谱鉴定互作病毒蛋白的种类。采用PCR将Strep标签融合于筛选出的病毒蛋白编码基因的C端，分别克隆至pCAGGS载体，获得分别表达各病毒蛋白的重组质粒。将表达各病毒蛋白的重组质粒分别与表达C962R-Strep的重组质粒共转染HEK293T细胞，36 h后采用Co-IP试验进一步验证获得的与ASFV C962R蛋白互作的病毒蛋白。Strep pull-down试验结果显示，rC962R-mCherry感染的PAM细胞、ASFV Pig/HLJ/2018株感染的PK-15-962-Strep细胞中均出现100 ku的特异性条带。质谱鉴定结果显示，共筛选出3种病毒蛋白：A137R、K145R和K205R蛋白。Co-IP结果显示，IP样品中分别出现约16 bp、17 bp的特异性条带，对应为病毒的A137R和K145R蛋白。表明仅有A137R和K145R蛋白与C962R蛋白存在相互作用。本研究为以C962R蛋白为靶蛋白的新型抗ASFV药物及疫苗的研发提供实验依据。
-
单位兽医生物技术国家重点实验室; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
