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摘要
目的建立一种肝活检组织中 HBV 共价闭合环状 DNA(cccDNA)的定量检测方法。方法待检肝组织标本共21份,来源于江苏省人民医院肝脏手术患者,包括19份慢性 HBV 感染,其中 HBeAg(+)标本10份,HBeAg(-)标本9份,4份非 HBV 感染为阴性对照组,取 HBV DNA 阳性的患者外周血作为 rcDNA 组。检测方法的主要步骤为肝组织经蛋白酶 K 和细胞裂解缓冲液消化后,用液相抽提法提取核酸,将提取的核酸溶液分为2等份。1份用特异性降解单链 DNA 的核酸酶加以消化,纯化后使用跨缺口引物和 SYBR Green Ⅰ荧光染料进行实时荧光定量 PCR 分析;另1等份则用以-定量检测肝细胞看家基因(β-Globin)作为样本细胞参数。检测结果的特异性主要通过 PCR 反应产物的序列分析及 rcDNA 组结果的对照进行证实,HBeAg(+)组和 HBeAg(-)组 cccDNA 水平的差异通过两样本 t 检验进行分析。结果 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增产物的碱基数为350 bp左右,DNA 测序分析提示产物与目的片段的序列符合率为99%以上,且以 rcDNA 为对照的结果均为阴性,排除最有可能造成假阳性的 rcDNA 对结果的干扰。本方法对10 mg HBeAg(+)肝组织标本的cccDNA 的检测阳性率为100%。血清 HBeAg(+)的肝组织样本的平均 HBV cccDNA 水平高于HBeAb(+)的肝组织标本(P<0.05)。结论通过上述三种途径证实了本文所建立方法的特异性。应用 SYBR Green Ⅰ荧光染料和β-Globin 作为样本细胞参数所建立的实时荧光定量 PCR 方法检测肝细胞内 HBV cccDNA,具有较高的特异性、敏感性,且成本较低的特点。
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单位南京医科大学第一附属医院
