利用慢病毒载体构建稳定干扰AMPKα1的HeLa细胞系

作者：李树朋; 陈浩; 林晓莹; 林广宏; 赵斌; 钟望涛; 李文; 冯杜

来源：海南医学, 2017, 28(23): 3785-3789.

• 慢病毒载体
• AMPKα1
• RNA干扰
• Hela细胞
• Metformin

目的建立稳定干扰AMPKα1的He La细胞系。方法利用AMPKα1慢病毒干扰质粒PLKO.1-puro-AMPKα1转染293T细胞制备重组慢病毒,然后用重组慢病毒感染He La细胞,荧光显微镜观察病毒感染效率,免疫印迹实验检测Sh-AMPKα1病毒感染组的AMPKα1表达。然后采用嘌呤霉素筛选出稳定干扰AMPKα1的He La细胞单克隆,免疫印迹实验和免疫荧光实验检测AMPKα1表达情况。最后用AMPK激活剂Metformin实验验证AMPKα1稳定干扰的Hela细胞中AMPKα1蛋白的表达以及AMPKα1的生物功能。结果荧光拍照结果显示慢病毒成功感染Hela细胞;免疫印迹实验显示特异性Sh-AMPKα1病毒感染组的AMPKα1表达[(0.58±0.02)DPI]比WT组[(1.00±0.00)DPI]低,免疫荧光实验结果也显示Sh-AMPKα1病毒感染组中AMPKα1的平均光密度[(0.09±0.01)IOD/area]比WT组[(1.00±0.00)IOD/area]要低,差异均具有显著统计学意义(P<0.01);经AMPK激活剂Metformin处理后,AMPKα1稳定干扰的Hela细胞中仍无AMPKα1蛋白表达,并且Sh-AMPKα1组中LC3-Ⅱ/Ⅰ/Actin[(1.00±0.00I)DPI]也显著低于HA-AMPKα1组[(1.62±0.02)DPI],表明病毒感染组细胞中AMPKα1不能发挥其生物功能,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。结论利用Sh RNA-AMPKα1慢病毒筛选出了高效干扰AMPKα1表达的He La细胞系,为后续深入研究AMPKα1的生物功能奠定了基础。

• 单位
  神经内科; 广东医科大学附属医院; 广东医科大学