产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因和草酰辅酶A脱羧酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

作者：杨欢; 陈志强; 叶章群; 王博涵; 艾丽娅; 姚炜敏

来源：中华实验外科杂志, 2012, (06): 1072-1075+1207.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.06.026

• 产甲酸草酸杆菌
• 慢病毒载体
• 高草酸尿症

目的构建国人肠道来源产甲酸草酸杆菌(OxCF)甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)基因(FRC)和草酰辅酶A脱羧酶(OCoAD)基因(OXC)的重组慢病毒pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED,为高草酸尿症的基因治疗奠定基础。方法采用Taq高保真DNA聚合酶从OxCF基因组中扩增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收,用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-T Simple载体连接获得FRC和OXC的克隆载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并测序,筛选携带完整目的基因质粒pMD18T simple-FRC和pMD18T simple-OXC,用BamHⅠ酶切获得目的基因,连接FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6.3/v5DEST-IRES-EGFP,连接OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-DsRED,转化DH5α后挑取阳性克隆并测序。构建的慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染HEK293T细胞,包装并测滴度。结果聚合酶链反应(PCR)从OxCF基因组中扩增分获得1.3 kb和1.7 kb的DNA片段,与Genbank中FRC(U82167)间碱基序列匹配率为95.88%,存在53个碱基的变异;与Genbank中OXC(M77128)间碱基序列匹配率为93.61%,存在109个碱基的变异;测序证实pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED分别含有大小正确的正向FRC cDNA和OXC cDNA,转染HEK293T细胞实验24 h后,在荧光显微镜下相应可见大量绿色荧光和红色荧光,两种慢病毒滴度分别为1.15×10~8TU/ml和9.75×10~7TU/ml。结论成功构建表达OxCF中草酸分解关键基因FRC和OXC的重组慢病毒载体,并通过转染293细胞制备了高滴度慢病毒。

• 单位
  华中科技大学同济医学院附属同济医院