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摘要
邻苯二甲酸(2-乙基己基酯)(DEHP)是一种广泛使用的增塑剂,具有显著的雄性生殖毒性,可引起职业暴露人群血清睾酮和精子活力下降,精子数量减少。然而,全球范围内还没有完善的DEHP职业接触限值和职业危害防护措施。为了推进DEHP职业接触限值的研究,加强DEHP对雄性生殖毒性的防治,促进DEHP职业暴露人群的健康安全,采用动物实验证实了DEHP对雄性生殖毒性的影响,基于DEHP诱导的睾丸组织差异性表达pi RNA和PIWI蛋白预测DEHP诱导雄性生殖毒性的调控通路,探究预测通路在体内动物模型和体外细胞模型中的作用,初步提出了DEHP诱导雄性生殖毒性灵敏的效应指标以及可能的作用机理。筛选出DEHP诱导雄性生殖毒性可能的调控通路,为DEHP暴露灵敏效应标志物的筛选和职业接触限值的研究提供了基础的研究方向。构建DEHP暴露的大鼠模型,分别用pi RNA芯片和Western blot法检测大鼠睾丸组织pi RNA和PIWI蛋白表达水平,结果发现,DEHP暴露组大鼠睾丸中1351个pi RNA表达上调,944个pi RNA表达下调,选择10个经实时荧光定量PCR法检测验证的差异性表达pi RNA,用生物信息学方法进行靶基因预测以及GO和KEGG pathway富集,文献研究法探讨差异性表达的PIWI亚家族Piwil2蛋白的调控通路,综合分析差异性表达pi RNA和Piwil2调控通路,经筛选和初步验证Piwil2/STAT3/p53、Piwil2/PI3K/Akt、INSR/IRS1/PI3K/Akt/Fox O1和AMPK/Fox O1通路可能参与DEHP诱导的雄性生殖毒性调控。研究了经筛选的通路在DEHP诱导雄性大鼠生殖毒性中的作用。用250、500、1000 mg/kg DEHP的剂量连续染毒雄性大鼠28天,检测血清睾酮水平、附睾精子浓度、睾丸组织结构改变、睾丸组织凋亡和自噬水平评价雄性生殖毒性,检测睾丸组织中筛选通路相关蛋白表达水平,以了解它们在DEHP诱导雄性生殖毒性中的作用。结果发现,血清睾酮在所有DEHP暴露组均下降,是DEHP暴露的敏感指标。250 mg/kg·day暴露组DEHP诱导细胞自噬避免细胞凋亡,在500和1000 mg/kg·day暴露组,自噬水平下降,DEHP激活线粒体凋亡通路,导致睾丸细胞凋亡增加,睾丸组织损伤,可能与STAT3/p53通路有关。INSR、IRS1、Piwil2和STAT3是DEHP暴露灵敏且稳定的指标,其表达水平在所有暴露组均显著降低,可以作为DEHP早期暴露生物效应标志物进行进一步研究。探讨了piRNA/PIWI调控的不同通路在DEHP代谢产物MEHP诱导小鼠初级精母细胞(GC-2spd)毒性中的作用。用0、1、10、100μM MEHP和100μM NAC+100μM MEHP分别处理GC-2spd细胞,检测MEHP处理组和抗氧化剂NAC预处理组细胞氧化应激水平、凋亡和自噬水平以及pi RNA/PIWI调控通路相关蛋白表达水平。结果显示,在10、100μM MEHP暴露组,MEHP通过氧化应激介导STAT3/p53通路调控线粒体凋亡通路导致GC-2spd细胞凋亡,MEHP还通过氧化应激影响PI3K/Akt/m TOR和AMPK/m TOR通路促进GC-2spd细胞自噬。DEHP雄性生殖毒性现有的敏感效应指标为睾酮,INSR、IRS1、Piwil2和STAT3可以作为新的效应指标进行进一步的筛选,DEHP通过氧化应激调节STAT3/p53和PI3K/Akt/m TOR影响雄性生殖毒性,为DEHP雄性生殖毒性的防治提供可能的作用靶点,研究结果为DEHP职业接触限值研究提供基础资料,对促进DEHP职业健康安全具有重要意义。
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