细粒棘球蚴TGF-βⅡ型受体不同结构域酵母双杂交载体的构建和自激活鉴定

作者：李亮; 张传山; 杨乐; 王丽敏; 吕国栋; 王俊华; 林仁勇

来源：中国病原生物学杂志, 2014, 9(05): 434-5.

DOI：10.13350/j.cjpb.140512

• 细粒棘球蚴
• 转化生长因子βⅡ型受体
• 酵母双杂交

目的构建细粒棘球蚴转化生长因子βⅡ型受体全长(EgTβRⅡ)、受体结合域(EgTβRⅡ-A)和激酶域(EgTβRⅡ-K)的酵母双杂交真核表达载体,检测重组融合蛋白对酵母Y2HGold菌株的毒性作用和自激活活性。方法采用Trizol法提取细粒棘球绦虫总RNA,反转录合成cDNA;PCR扩增EgTβRⅡ-A、EgTβRⅡ-K和EgTβRⅡ基因,分别克隆入pGADT7、pGBKT7载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定及序列测定正确后,采用PEG/LiAc法转入酵母菌,检测重组融合蛋白对酵母菌毒性和自激活活性。结果构建EgTβRⅡ-A、EgTβRⅡ-K和EgTβRⅡ的pGADT7、pGBKT7重组质粒,经双酶切和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到长度为406bp、1 023bp和1 824bp的目的基因片段,与预期结果一致;重组质粒转化酵母菌后形成的菌落与对照质粒pGBKT7转化菌的菌落生长状况一致,直径1.52.0mm,而在SD/-Leu/X/AbA、SD/-Trp/X/AbA平板上无菌落生长。结论成功构建EgTβRⅡ-A、EgTβRⅡ-K和EgTβRⅡ基因的pGADT7、pGBKT7真核表达载体,其表达蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性作用和自激活活性,重组质粒载体可用于酵母双杂交系统,为鉴定EgTβRⅡ在TGF-β/Smad通路中的生物学功能奠定了理论基础。

• 单位
  新疆医科大学第一附属医院; 新疆医科大学; 基础医学院