猪ARAF基因真核表达及其对PK15细胞凋亡的调控作用

作者：徐康智; 张会; 孙启亮; 蔺怡帆; 朱宇阳; 陈凌志; 徐凡; 苏丁泽阳; 朱世范; 刘丹丹; 许金俊; 潘志明; 陶建平^*; 候照峰^*

来源：中国兽医科学, 2022, 52(11): 1456-1464.

DOI：10.16656/j.issn.1673-4696.2022.0205

• ARAF基因
• 真核表达
• PK15细胞
• 亚细胞定位
• 细胞凋亡

为研究猪ARAF(v-raf murine sarcoma 3611 viral oncogene homo)lo基g因在PK15细胞的表达、定位及其对细胞凋亡的调控作用，本文以PK15细胞为研究对象，RT-PCR扩增猪ARAF基因CDS序列，经TA克隆至载体pGEM-T-Easy，随后加酶切位点和保护性碱基设计引物，PCR扩增后，构建重组真核表达载体pc DNA3.1-EGFP-ARAF，重组载体经脂质体法转染PK15细胞，荧光显微镜观察转染效果，qPCR与Westernblot分别检测A R A F基因mRNA和蛋白表达水平，间接免疫荧光试验观察猪A R A F的亚细胞定位；同时，流式细胞术及免疫印迹试验探究ARAF对PK15细胞凋亡的影响。结果显示，构建的重组真核表达载体转染成功，荧光显微镜检查可见转染组和空载组细胞均表达绿色荧光蛋白。转染组细胞ARAF基因mRNA及蛋白表达量较空载组和空白对照组显著升高（P<0.01）。激光共聚焦显微镜观察到该基因表达蛋白主要定位于PK15细胞胞质中。流式细胞术及免疫印迹试验检测时可见转染组PK15细胞凋亡率显著增加；相较空载组和空白对照组，转染组细胞中凋亡相关蛋白BAD (B-cell lymphoma-2 antagonist of cell d)e、aBtchl-2(B-cell lymphoma-2)蛋白的表达量无显著性变化，而BAX (B-cell lymphoma-2 associated) X、Cleaved caspase-3的蛋白表达量显著升高（P<0.01），显示高表达ARAF基因可促进PK15细胞的凋亡。上述研究结果为进一步深入探讨ARAF基因对PK15细胞调亡的调控机制研究奠定了重要基础。

• 单位
  扬州大学; 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心