MiR-22重组腺病毒的构建及对HepG2细胞葡萄糖摄取的影响

作者：廖立红; 袁文彬; 陈勇; 梁继超^*

来源：生物工程学报, 2020, 36(04): 763-771.

DOI：10.13345/j.cjb.190346

• miR-22
• 重组腺病毒
• 葡萄糖摄取
• 糖异生
• 基因治疗
• SIRT1

文中构建了miR-22重组腺病毒Ad-miR-22,分析了其对HepG2细胞胰岛素信号通路及葡萄糖摄取的抑制作用。通过PCR方法,扩增了miR-22的前体及侧翼序列,酶切后克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-22,经PCR及测序鉴定。穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,直接转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞BJ5183,产生重组腺病毒质粒Ad-miR-22,最后经PacⅠ线性化后转染包装细胞系293A。重组腺病毒经过3轮扩增后感染HepG2细胞,通过荧光定量PCR检测miR-22表达水平。通过葡萄糖摄取实验观察Ad-miR-22对HepG2细胞葡萄糖摄取的影响。采用Western blotting检测Ad-miR-22对HepG2细胞SIRT1在蛋白质水平的表达及GSK-3β磷酸化水平的影响。采用荧光定量PCR检测miR-22对PEPCK及G6Pase等基因在mRNA水平表达的影响。结果表明,重组腺病毒Ad-miR-22感染显著增加HepG2细胞miR-22表达水平。此外,Ad-miR-22显著抑制胰岛素诱导的HepG2葡萄糖摄取,并通过下调GSK-3β磷酸化抑制胰岛素信号通路的激活。Ad-miR-22反转胰岛素对糖异生关键酶表达的抑制作用,并下调SIRT1基因在蛋白质水平的表达。综上所述,构建了miR-22的重组腺病毒,发现其显著增加糖异生,抑制HepG2细胞葡萄糖摄取,该作用可能与miR-22调节SIRT1在蛋白质水平的表达有关。

• 单位
  湖北大学; 武汉大学中南医院