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摘要
目的 ：探讨Mettl3介导m6A甲基化修饰对过氧化氢(H2O2)诱导的脊髓神经元氧化应激和凋亡的影响。方法：分离新生(24h内)SD大鼠脊髓，经消化、离心后重悬沉淀，差速贴壁30min后收集未贴壁细胞培养于Neurobasal培养基中，经免疫荧光鉴定呈β3-tubulin阳性，确认为脊髓神经元。将脊髓神经元随机分为6组：空白组，细胞不予任何处理，正常培养；转染对照组，细胞转染阴性对照siRNA(si-NC)；转染组，细胞转染Mettl3siRNA(si-Mettl3)；诱导组，细胞采用300μmol/L的H2O2处理；转染对照诱导组，细胞先转染si-NC，然后采用300μmol/L H2O2处理；转染诱导组，细胞先转染si-Mettl3，然后采用300μmol/L H2O2处理。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞Mettl3的mRNA表达水平，Western blot检测Mettl3、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平，免疫荧光检测Mettl3表达，酶标仪检测各组整体m6A水平，并检测白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 ：与空白组相比，诱导组的m6A甲基化修饰水平显著提高(P<0.05),Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),IL-1β(73.39±8.82ng/L vs 125.58±15.31ng/L)、IL-6 (63.34±7.12ng/L vs 101.28±12.49ng/L)、TNF-α(103.29±12.19ng/L vs 204.37±23.65ng/L)和MDA (4.01±0.67pmol/L vs 9.23±1.05pmol/L)水平显著性升高(P<0.05),SOD(28.37±3.72U/mg vs 17.23±2.05U/mg)和GSHPx(158.19±19.26U/mg vs 83.35±9.05U/mg)水平显著性降低(P<0.05)，且Bax和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著性上调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平显著性下调(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高[(8.30±0.68)%vs(34.29±3.16)%,P<0.05]；与诱导组相比，转染诱导组的m6A甲基化修饰水平显著性降低(P<0.05),Mettl3的mRNA和蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),IL-1β(125.58±15.31ng/L vs 96.28±11.27ng/L)、IL-6 (101.28±12.49ng/L vs 84.56±10.24ng/L)、TNF-α(204.37±23.65ng/L vs 147.15±18.46ng/L)和MDA (9.23±1.05pmol/L vs7.28±0.96pmol/L)水平显著性降低(P <0.05),SOD (17.23±2.05U/mg vs 24.01±2.76U/mg)和GSH-Px (83.35±9.05U/mg vs 121.48±15.47U/mg)水平显著升高(P<0.05)，且Bax和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著性下调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平显著性上调(P<0.05)，细胞凋亡率显著性降低[(34.29±3.16)%vs(23.57±2.01)%,P<0.05]。与空白组相比，转染组的炎性因子、氧化应激和凋亡水平均无显著性差异(P>0.05)。结论：H2O2可上调脊髓神经元中m6A甲基化修饰水平，并可诱导氧化应激和细胞凋亡；抑制Mettl3表达能够降低H2O2诱导的脊髓神经元m6A甲基化修饰水平，进而缓解氧化应激和细胞凋亡。
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